Name: an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
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Diese Arbeit wurde von der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, Projektnummer 850681), der Hochschule für angewandte Wissenschaften Upper Austria grundlegende Finanzierung-Initiative (Projekt GlucoSTAR) und das Zentrum für technologische Innovation in der Medizin (Training Center) finanziert. Grundfinanzierung durch das Land Oberösterreich erhält.

Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission.
1. Lagerung und Zucht der Eier
<ol><li>Erhalten Sie von einem lokalen Züchter befruchteten Hühnereiern (Table of Materials). Hinweis: Eiern können bis zu 10 Tage nach der Verlegung vor Gebrauch für Experimente bei 14 ° C in eine feuchte Atmosphäre gespeichert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eizellen bei 38 ° C mit einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 40-60 % für 10 oder 11 Tage im Brutkasten verwandelt, die ständig die Eiern.</li>
</ol>2. Auswahl der Eizellen
<ol><li>Überprüfen Sie die Eizellen zur Befruchtung nach Inkubation von bis zu 11 Tagen. Verwenden Sie ein candling Licht für diesen Schritt. Tauchen Sie am Rande des candling Lampe in ein Stempelkissen und Kerze der Spitzen Seite des Eies.</li>
	<li>Um das Luftpolster zu identifizieren, überprüfen Sie auf Unterschiede in der Helligkeit auf der Oberseite das Ei. Hinweis: Das Luftpolster erscheint als ein runder, transparenter Region, während das Eiweiss dunkler ist, wenn das Ei candled ist.</li>
	<li>Markieren Sie nach der Entdeckung der Luft Blase durch Drücken der Lampe leicht gegen das Ei mit der vorher verwendeten Tinte.</li>
	<li>Schließen Sie nicht befruchteten Eiern bei diesem Schritt die einen Unterschied in der Helligkeit zwischen dem Eiweiss und Luftpolster nicht zeigen aus.</li>
</ol>3. Injektion von Substanzen
<ol><li>Bereiten Sie die Substanz von Interesse (z.B., Kräuterextrakt oder Insulin) durch Verdünnen der Substanz in der gewünschten Konzentration in Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) Puffer. Zum Beispiel 3,3 U/mL eine kommerziell verfügbare Insulin analoge in HBSS.</li>
	<li>Picken Sie für die Anwendung der ausgewählten Verbindung sorgfältig die Eierschale mit einer Spitzen Pinzette in den markierten Bereich der Luft-Blase. Bilden Sie ein Loch größer als der Durchmesser der Nadel der Spritze nicht. Die Pufferlösung (300 µL), die den Stoff von Interesse in der gestrichelte Bereich über eine Spritze zu injizieren. Hinweis: Verwenden Sie steril, 1-ml Einweg-Spritzen, Pipettenspitzen und Schiffe. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel für die Experimente.</li>
	<li>Um Blut Glukose-reduzierende Wirkung eines Stoffes zu ermitteln, legen Sie die Eiern zurück in den Brutkasten für 60, 120 und 180 min, bzw.. Um basale Blutzuckerspiegel zu bestimmen, sind mindestens 10-15 unbehandelten Kontrolle Eiern.</li>
</ol>4. Toxizitätstests
<ol><li>Nach Anwendung der ausgewählten Verbindung für 24 h, equilibrate die Eierschale Membran mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran) für mindestens 30 s.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Überprüfen Sie Blutgefäße für Läsionen und bestätigen Sie Vitalität (z.B. Bewegung) des Embryos Küken. Hinweis: Siehe Abbildung 1 für den Vergleich des vital im Vergleich zu nicht-vital Embryonen nach dem Auftragen eine giftige Kräuter-Extrakt.</li>
</ol>5. Messung der Blutzuckerwert
<ol><li>Zum jeweiligen Zeitpunkt sorgfältig entfernen Sie die Eierschale über das Luftpolster und equilibrate der Eierschalen Membran mit PBS-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran).</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie und entfernen Sie die chorioallantoic Membrane mit einer Mikro-Schere, um guten Zugang zu geeigneten Blutgefäße zu ermöglichen. Schneiden Sie die Membran mit mindestens 2-3 cm. Schneiden Sie keine großen Schiffe in die Membran selbst unerwünschte Blutverlust des Embryos zu vermeiden.</li>
	<li>Suchen Sie das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos. Heben Sie dieses Schiff aus das Eiweiss mit einer geschlossenen Mikro-Schere und legen Sie es auf einem Kunststoff pH-Streifen. PH-Streifen unter dem Behälter, die mit Mikro-Schere stattfindet, zu bewegen und zurückziehen der Mikro-Schere entfernt sorgfältig.</li>
	<li>Nehmen Sie 1 bis 2 mL der Flüssigkeit unter die chorioallantoic Membrane mit einer Pipette zur Verdünnung des Blutes in den nächsten Schritt zu vermeiden. Trocknen Sie die Behälter und pH-Streifen mit Filterpapier, bevor das Schiff geschnitten wird.</li>
	<li>Schneiden Sie das Blutgefäß sorgfältig mit einer Mikro-Schere auf einer Seite. Schneiden Sie durch das Gefäß nicht vollständig aus. Hinweis: Das Schiff ist ca. 1 mm dick. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Schiffes zu vermeiden, Schneiden durch das Gefäß vollständig, da es nicht am Strip rutschen kann und keine Blutentnahme möglich ist.</li>
	<li>Sammeln Sie die undichte Blut auf den pH-Streifen mit einer Pipette. 10 Mikroliter Blut müssen Blutzuckerspiegel mit dem Blutzuckermessgerät zu bestimmen.</li>
</ol>6. Statistische Auswertung
<ol><li>Berechnen Sie den Mittelwert aus mindestens 10 einzelnen Eiern pro Zeitpunkt und Normalisieren Sie diese Werte zu einem Steuerelement Eier (oder Puffer-unbehandelte Eiern) zu.</li>
	<li>Anschließend bestimmen Sie den Prozentsatz der Abnahme. Darüber hinaus nutzen Sie Insulin als Positivkontrolle. Hinweis: Wiederholen Sie jedes Experiment mindestens dreimal.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der HET-CAM-Assay ist eine weit verbreitete alternative Testsystem zu Tierversuchen in der Industrie-12. Das hier beschriebene in Ovo -System stellt eine modifizierte Version des HET-CAM-Assays. Während in seiner ursprünglichen Form HET-CAM Experimente werden durchgeführt, um die irritierenden Eigenschaften von Verbindungen und Formulierung oder die Analyse der Angiogenese14,15,16studieren, haben wir das Konzept zu testen angepasst Verbindungen mit vermeintlichen Insulin-mimetischen Eigenschaften12. Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission, da diese Experimente nicht Tierversuche gelten. Jüngste Studien haben bewiesen, die Eignung des in Ovo Systems, um die Wirksamkeit von ausgewählten Kräuter-Extrakten, charakterisieren die in einer GLUT4-Translokation-basierten primären Bildschirm10, Senkung des Blutzuckerspiegels in identifiziert wurden die das Fehlen von Insulin12,13. Kritische Punkte für eine gute Leistung des Systems in Ovo gehören: Erstens eine zuverlässige Züchter liefern die befruchteten Eizellen. Die klassische braune Hühner Lohmann ist eine gute Wahl der Rasse. Zweitens prüft die Umsetzung der Toxizität auszuschließende toxische Wirkungen der untersuchten Verbindung muss getan werden. Darüber hinaus ist die Vorbereitung eines geeigneten Blutgefäßes zur Blutentnahme wichtig. Es ist wichtig, das Schneiden von großen Schiffen in der chorioallantoic Membrane selbst, zu vermeiden, da dies zu einer nicht vorzuziehen Blutverlust führen kann. Darüber hinaus, bevor das Schiff auf den pH-Streifen geschnitten wird, hat es gestreichelt zu werden trocken mit Filterpapier um Verdünnung der das gesammelte Blut zu verhindern. Schließlich scheint eine ausreichende Anzahl von Experimenten wichtig zu sein. Es wird empfohlen, mit mindestens 10 Eizellen für jeden Zeitpunkt und eine dreifache Wiederholung des jeweiligen Experiments.
Natürlich gibt es einige Einschränkungen dieses Ansatzes in Ovo . Da es bis zu 30 Minuten dauert, bis die Stoffe durch die Eierschale Membran absorbiert und in engem Kontakt mit der chorioallantoic Membrane kommen, ist es nicht möglich, eine schnelle Reaktion des Embryos bei der angewandten Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können einige Verbindungen in die angewandte Konzentration giftig sein führt häufig zu Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane. Zytotoxizität Tests basierend auf langfristige Inkubation der Verbindungen für ca. 24 Stunden erscheint daher angemessen. Schließlich fanden wir, dass das Puffersystem für die Anwendung der Verbindungen eine erhebliche Auswirkungen auf die Leistung des Tests hat. 12 derzeit HBSS Puffer verwendet, da es in der kleinsten Wirkung auf den Blutzuckerspiegel des Embryos führt.
Für zukünftige Anwendungen möglicherweise zusätzlichen Puffersysteme als Alternative zu HBSS getestet werden. Darüber hinaus könnte der Einfluss von pflanzlichen Extrakten auf zusätzliche Blutwerte wie Cholesterin, Triglyceride oder Lipoproteine eine attraktive Frage sein.
Unser neues in-Ovo -System ist ein vielversprechender und wichtige Werkzeug, Stoffe mit Insulin-mimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus ohne die Notwendigkeit einen Tierversuch zu testen. Daher, es füllt die Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Ansätzen. Im Vergleich zu bestehenden in Ovo Modell Systeme17 entfällt induzieren Diabetes durch die Streptozocin (STZ) Behandlung, wie wir Embryonen am Tag 10 oder 11 der Inkubation zu verwenden. In diesem Stadium Insulin-Produktion hat noch nicht begonnen, aber die Embryonen sind bereits Insulin empfindlich. Darüber hinaus kann Erlaubnis von einer Ethikkommission erforderlich sein, wenn Embryonen im Alter von 14-17 Tagen verwendeten17sind. Darüber hinaus ist im Vergleich zu alternativen Strategien18, die zusammengesetzte Anwendung wie hier beschrieben weniger schädlich und mühsam, Erhöhung experimentelle Durchsatz.
Zusammen genommen, diese in Ovo ist Ansatz ein attraktives System, wenn eine Blut-abnehmender Wirkung einer Insulin-mimetische Substanz muss in einem lebenden Organismus getestet werden.

Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie gekennzeichnet und wird durch defekte Insulinsekretion oder Insulin Aktion1verursacht. Neunzig Prozent aller Diabetesfälle sind Kategorie Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), wo Einzelpersonen zu demonstrieren, Insulin-Resistenz und vor allem Insulin-Mangel2. Mehrere Faktoren sind dafür bekannt, die globale Inzidenz von T2DM, einschließlich Veränderungen im Lebensstil, insbesondere die Überernährung, Altern und Bewegungsmangel erhöhen. Rund 400 Millionen Menschen haben Diabetes Mellitus nach der International Diabetes Federation (IDF) weltweit. Diese Zahl wird voraussichtlich 600 Millionen innerhalb der nächsten 20 Jahre3zu erreichen.
Diabetische Komplikationen verursacht durch Hyperglykämie und Insulinresistenz, wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen, Glukoseintoleranz, koronare Herzkrankheit und zerebralen Gefäßerkrankungen, führen zu einer deutlich reduzierten Lebenserwartung und Qualität4. Betroffenen Personen erfordern Glukose-senkenden Pharmakotherapie; Allerdings ist die Verwendung von Drogen wie Metformin5 oft verbunden mit dramatischen Nebenwirkungen6,7,8. Daher sind weitere Antidiabetika Ansätze, die sicher, weithin verfügbar und kostengünstig sind erforderlich.
Verschiedene pflanzliche Verbindungen, Extrakte, Pflanzen und Nutraceuticals sind Feature-Insulin-mimetischen Eigenschaften zugeschrieben worden, durch die Modulation verschiedene Zellfunktionen. Ein wichtiges Merkmal ist die Stimulation der die Translokation von glukosetransporters 4 (GLUT4) an der Plasmamembran von intrazellulären Staufächer, wodurch eine erhöhte Aufnahme von Glucose in Muskel und Fettgewebe in Abwesenheit von Insulin, bekannt als Insulin-mimetischen Eigenschaften9. Zuvor haben wir einen Fluoreszenz-Mikroskopie-basierter Ansatz zur Quantifizierung des Translokation Prozess von GLUT410implementiert. Analyse der zahlreichen Pflanzenextrakte aus Extrakt Bibliothek11 mit dieser Assay führte bei der Identifizierung von vielversprechenden Kandidaten. Weitere Tests in lebenden Organismen sind jedoch erforderlich. In diesem Papier, eine modifizierte Küken Embryos Modell ausführlich beschriebene Ansatz erweist sich ein zukunftsträchtiges Modell zur Identifizierung von Substanzen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften. Es stellt ein attraktives Instrument, die große Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Studien und bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Systemen wie akzeptablen Kosten, einfache Handhabung und angemessene Durchsatzraten. Darüber hinaus ist die Berechtigung von einer Ethikkommission nicht erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td><td>Local Breeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>5942861</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&amp;auml;te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extracts</td><td>PEKISH extract library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamp Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

Erhöhte Blutzuckerwerte bei Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM), eine komplexe und multifaktorielle Stoffwechselerkrankung werden durch Insulin-Resistenz und β-Zellen Ausfall verursacht. Verschiedene Strategien, einschließlich die Injektion von Insulin oder die Verwendung von Insulin-sensibilisierende Medikamente wurden fortgesetzt, um T2DM zu behandeln oder zumindest die Symptome zu reduzieren. Darüber hinaus hat die Anwendung von pflanzlichen Verbindungen immer mehr Aufmerksamkeit erregt. Daher ist es notwendig, effiziente Testsysteme zu identifizieren und zu charakterisieren, Insulin-mimetischen Verbindungen zu finden. Hier haben wir eine modifizierte Küken Embryos Modell, das ermöglicht das Testen der synthetischen Verbindungen und Kräuterextrakte mit Insulin-mimetischen Eigenschaften entwickelt. Mit einer Fluoreszenz Mikroskopie-basierten primären Bildschirm, der die Translokation von glukosetransporters 4 (Glut4) an der Plasmamembran quantifiziert, konnten wir Verbindungen, vor allem pflanzliche Extrakte zu identifizieren, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Glukose führen Konzentrationen in Adipozyten. Die Wirksamkeit dieser Substanzen erfordert jedoch weitere Überprüfung in einem lebenden Organismus. So haben wir in Ovo Ansatz, um deren Blut Glukose-reduzierenden Eigenschaften zu identifizieren. Die Zulassung durch eine Ethik-Kommission ist nicht erforderlich, da die Verwendung von Hühnerembryos während der ersten zwei Drittel der Embryonalentwicklung keinen Tierversuch angesehen wird. Hier wird die Anwendung dieses Modells im Detail beschrieben.

Beschreibung des Gluc-HET-Ansatzes:
Nach der Inkubation mit den Stoffen von Interesse die befruchteten Eizellen geöffnet und bereit für die Blutentnahme durch Beseitigung der Eierschale (Abbildung 2). Weitere Vorbereitung umfasst Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran für den Zugriff auf die chorioallantoic Membrane. Diese Membran ist dann sorgfältig geschnitten, um Zugang zu einem geeigneten Blutgefäß zur Blutentnahme. Vorzugsweise ist das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos auf Kunststoff pH-Streifen gelegt. Zur Verdünnung des Blutes während der Erfassung zu vermeiden, ist das Schiff und pH-Streifen klopfte trocken mit Filterpapier. Das Blutgefäß wird dann geschnitten und Blut austritt auf die pH-Streifen ist für die Analyse mit einer Pipette gesammelt.
Auswirkungen auf den Blutzuckerspiegel ausgewählte Kräuterextrakte:
Mit einem kürzlich ins Leben gerufene GLUT4-Translokation Quantifizierung-basierten primären Bildschirm sind wir in der Lage, Stoffe zu identifizieren, mit einem Insulin-mimetischen charakteristischen10. Screening von Hunderten von wasserlöslichen Kräuterextrakte führte bei der Identifizierung von mehreren Treffern. Diese Extrakte wurden in unserem in -Ovo Modell getestet. Für diese Experimente wurden Auszüge aus Combretum Indicum (Rangoon Creeper) vorbereitet und ein nicht offengelegt-Extrakt (Extrakt 0845 bezeichnet) verwendet. Wir aufgelöst die Extrakte in HBSS Puffer bei 300 mg/L, eine Konzentration, die in früheren Studien12,13geeignet herausstellte. Auf die Embryonen für 11 Tage inkubiert wurden Substanzen angewendet. Wie in Abbildung 3gezeigt, hat der Extrakt aus Rangoon Creeper keine bedeutende Blut Glukose Reduktion in Ovogeführt. Jedoch wurde die Blut-Glukose-Konzentration erfolgreich reduziert mit Extrakt 0845, mit einer geringfügigen Abnahme nach 60 min, das ist vergleichbar mit der Wirkung, die mit einem im Handel erhältlichen Insulin analoge beobachtet. Eine signifikante Wirkung wurde beobachtet, wenn die Inkubationszeit der Eier verlängert wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Abbildung 1: Einfluss von toxischen Verbindungen auf Embryo Vitalität. Eiern inkubiert für 11 Tage (A und C) oder mit einer giftigen Kräuterextrakt am Tag 10 für ein weiteres 24 h behandelt wurden (B und D). Anwendung des Extrakts führte zu schweren Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane (D) und der Embryo (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Abbildung 2: Beschreibung des Modells in Ovo . Von links nach rechts: Eröffnung und Entfernung der Eierschale (1-2); Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran mit chorioallantoic Membrane ausgesetzt sind (3); vorbereitete Gefäß auf einem pH-Streifen (4); die Gewinnung von Blut und Messung der Glukosekonzentration unter Verwendung einer Glukose Meter (5). Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Abbildung 3: Wirkung von Kräuter-Extrakten auf den Blutzuckerspiegel im Vergleich zu unbehandelten oder Insulin-behandelten Eiern. Eiern waren für 11 Tage inkubiert und mit den angegebenen Substanzen behandelt (im Handel erhältlichen Insulin analoge: 3,3 U/mL; Extrakte: 300 mg/L) aufgelöst in HBSS Puffer (300 µL Volumen) für bis zu 3 h Blut Blutzuckerspiegel über ein Blutzuckermessgerät ermittelt wurden. Ergebnisse werden ohne die Wirkung des Puffers angezeigt. Fehlerindikatoren basieren auf den Standardfehler des Mittelwerts. * P < 0,05 und *** P < 0,0001, bedeutende Abnahme in Bezug auf HBSS-behandelten Eiern der Inkubation gleichzeitig. Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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Serie: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Forschung

Biotechnik

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Biologie

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Medizin

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Studie von In Vivo Metabolismus von Glukose in fettreichen Diät gefüttert Mäuse mit oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em&gt; In vitro</em&gt; Kultivierte menschliche primäre Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Zusammenfassung

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Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen

Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster