Diese Arbeit wurde von der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, Projektnummer 850681), der Hochschule für angewandte Wissenschaften Upper Austria grundlegende Finanzierung-Initiative (Projekt GlucoSTAR) und das Zentrum für technologische Innovation in der Medizin (Training Center) finanziert. Grundfinanzierung durch das Land Oberösterreich erhält.

Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission.
1. Lagerung und Zucht der Eier
<ol><li>Erhalten Sie von einem lokalen Züchter befruchteten Hühnereiern (Table of Materials). Hinweis: Eiern können bis zu 10 Tage nach der Verlegung vor Gebrauch für Experimente bei 14 ° C in eine feuchte Atmosphäre gespeichert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eizellen bei 38 ° C mit einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 40-60 % für 10 oder 11 Tage im Brutkasten verwandelt, die ständig die Eiern.</li>
</ol>2. Auswahl der Eizellen
<ol><li>Überprüfen Sie die Eizellen zur Befruchtung nach Inkubation von bis zu 11 Tagen. Verwenden Sie ein candling Licht für diesen Schritt. Tauchen Sie am Rande des candling Lampe in ein Stempelkissen und Kerze der Spitzen Seite des Eies.</li>
	<li>Um das Luftpolster zu identifizieren, überprüfen Sie auf Unterschiede in der Helligkeit auf der Oberseite das Ei. Hinweis: Das Luftpolster erscheint als ein runder, transparenter Region, während das Eiweiss dunkler ist, wenn das Ei candled ist.</li>
	<li>Markieren Sie nach der Entdeckung der Luft Blase durch Drücken der Lampe leicht gegen das Ei mit der vorher verwendeten Tinte.</li>
	<li>Schließen Sie nicht befruchteten Eiern bei diesem Schritt die einen Unterschied in der Helligkeit zwischen dem Eiweiss und Luftpolster nicht zeigen aus.</li>
</ol>3. Injektion von Substanzen
<ol><li>Bereiten Sie die Substanz von Interesse (z.B., Kräuterextrakt oder Insulin) durch Verdünnen der Substanz in der gewünschten Konzentration in Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) Puffer. Zum Beispiel 3,3 U/mL eine kommerziell verfügbare Insulin analoge in HBSS.</li>
	<li>Picken Sie für die Anwendung der ausgewählten Verbindung sorgfältig die Eierschale mit einer Spitzen Pinzette in den markierten Bereich der Luft-Blase. Bilden Sie ein Loch größer als der Durchmesser der Nadel der Spritze nicht. Die Pufferlösung (300 µL), die den Stoff von Interesse in der gestrichelte Bereich über eine Spritze zu injizieren. Hinweis: Verwenden Sie steril, 1-ml Einweg-Spritzen, Pipettenspitzen und Schiffe. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel für die Experimente.</li>
	<li>Um Blut Glukose-reduzierende Wirkung eines Stoffes zu ermitteln, legen Sie die Eiern zurück in den Brutkasten für 60, 120 und 180 min, bzw.. Um basale Blutzuckerspiegel zu bestimmen, sind mindestens 10-15 unbehandelten Kontrolle Eiern.</li>
</ol>4. Toxizitätstests
<ol><li>Nach Anwendung der ausgewählten Verbindung für 24 h, equilibrate die Eierschale Membran mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran) für mindestens 30 s.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Überprüfen Sie Blutgefäße für Läsionen und bestätigen Sie Vitalität (z.B. Bewegung) des Embryos Küken. Hinweis: Siehe Abbildung 1 für den Vergleich des vital im Vergleich zu nicht-vital Embryonen nach dem Auftragen eine giftige Kräuter-Extrakt.</li>
</ol>5. Messung der Blutzuckerwert
<ol><li>Zum jeweiligen Zeitpunkt sorgfältig entfernen Sie die Eierschale über das Luftpolster und equilibrate der Eierschalen Membran mit PBS-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran).</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie und entfernen Sie die chorioallantoic Membrane mit einer Mikro-Schere, um guten Zugang zu geeigneten Blutgefäße zu ermöglichen. Schneiden Sie die Membran mit mindestens 2-3 cm. Schneiden Sie keine großen Schiffe in die Membran selbst unerwünschte Blutverlust des Embryos zu vermeiden.</li>
	<li>Suchen Sie das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos. Heben Sie dieses Schiff aus das Eiweiss mit einer geschlossenen Mikro-Schere und legen Sie es auf einem Kunststoff pH-Streifen. PH-Streifen unter dem Behälter, die mit Mikro-Schere stattfindet, zu bewegen und zurückziehen der Mikro-Schere entfernt sorgfältig.</li>
	<li>Nehmen Sie 1 bis 2 mL der Flüssigkeit unter die chorioallantoic Membrane mit einer Pipette zur Verdünnung des Blutes in den nächsten Schritt zu vermeiden. Trocknen Sie die Behälter und pH-Streifen mit Filterpapier, bevor das Schiff geschnitten wird.</li>
	<li>Schneiden Sie das Blutgefäß sorgfältig mit einer Mikro-Schere auf einer Seite. Schneiden Sie durch das Gefäß nicht vollständig aus. Hinweis: Das Schiff ist ca. 1 mm dick. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Schiffes zu vermeiden, Schneiden durch das Gefäß vollständig, da es nicht am Strip rutschen kann und keine Blutentnahme möglich ist.</li>
	<li>Sammeln Sie die undichte Blut auf den pH-Streifen mit einer Pipette. 10 Mikroliter Blut müssen Blutzuckerspiegel mit dem Blutzuckermessgerät zu bestimmen.</li>
</ol>6. Statistische Auswertung
<ol><li>Berechnen Sie den Mittelwert aus mindestens 10 einzelnen Eiern pro Zeitpunkt und Normalisieren Sie diese Werte zu einem Steuerelement Eier (oder Puffer-unbehandelte Eiern) zu.</li>
	<li>Anschließend bestimmen Sie den Prozentsatz der Abnahme. Darüber hinaus nutzen Sie Insulin als Positivkontrolle. Hinweis: Wiederholen Sie jedes Experiment mindestens dreimal.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der HET-CAM-Assay ist eine weit verbreitete alternative Testsystem zu Tierversuchen in der Industrie-12. Das hier beschriebene in Ovo -System stellt eine modifizierte Version des HET-CAM-Assays. Während in seiner ursprünglichen Form HET-CAM Experimente werden durchgeführt, um die irritierenden Eigenschaften von Verbindungen und Formulierung oder die Analyse der Angiogenese14,15,16studieren, haben wir das Konzept zu testen angepasst Verbindungen mit vermeintlichen Insulin-mimetischen Eigenschaften12. Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission, da diese Experimente nicht Tierversuche gelten. Jüngste Studien haben bewiesen, die Eignung des in Ovo Systems, um die Wirksamkeit von ausgewählten Kräuter-Extrakten, charakterisieren die in einer GLUT4-Translokation-basierten primären Bildschirm10, Senkung des Blutzuckerspiegels in identifiziert wurden die das Fehlen von Insulin12,13. Kritische Punkte für eine gute Leistung des Systems in Ovo gehören: Erstens eine zuverlässige Züchter liefern die befruchteten Eizellen. Die klassische braune Hühner Lohmann ist eine gute Wahl der Rasse. Zweitens prüft die Umsetzung der Toxizität auszuschließende toxische Wirkungen der untersuchten Verbindung muss getan werden. Darüber hinaus ist die Vorbereitung eines geeigneten Blutgefäßes zur Blutentnahme wichtig. Es ist wichtig, das Schneiden von großen Schiffen in der chorioallantoic Membrane selbst, zu vermeiden, da dies zu einer nicht vorzuziehen Blutverlust führen kann. Darüber hinaus, bevor das Schiff auf den pH-Streifen geschnitten wird, hat es gestreichelt zu werden trocken mit Filterpapier um Verdünnung der das gesammelte Blut zu verhindern. Schließlich scheint eine ausreichende Anzahl von Experimenten wichtig zu sein. Es wird empfohlen, mit mindestens 10 Eizellen für jeden Zeitpunkt und eine dreifache Wiederholung des jeweiligen Experiments.
Natürlich gibt es einige Einschränkungen dieses Ansatzes in Ovo . Da es bis zu 30 Minuten dauert, bis die Stoffe durch die Eierschale Membran absorbiert und in engem Kontakt mit der chorioallantoic Membrane kommen, ist es nicht möglich, eine schnelle Reaktion des Embryos bei der angewandten Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können einige Verbindungen in die angewandte Konzentration giftig sein führt häufig zu Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane. Zytotoxizität Tests basierend auf langfristige Inkubation der Verbindungen für ca. 24 Stunden erscheint daher angemessen. Schließlich fanden wir, dass das Puffersystem für die Anwendung der Verbindungen eine erhebliche Auswirkungen auf die Leistung des Tests hat. 12 derzeit HBSS Puffer verwendet, da es in der kleinsten Wirkung auf den Blutzuckerspiegel des Embryos führt.
Für zukünftige Anwendungen möglicherweise zusätzlichen Puffersysteme als Alternative zu HBSS getestet werden. Darüber hinaus könnte der Einfluss von pflanzlichen Extrakten auf zusätzliche Blutwerte wie Cholesterin, Triglyceride oder Lipoproteine eine attraktive Frage sein.
Unser neues in-Ovo -System ist ein vielversprechender und wichtige Werkzeug, Stoffe mit Insulin-mimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus ohne die Notwendigkeit einen Tierversuch zu testen. Daher, es füllt die Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Ansätzen. Im Vergleich zu bestehenden in Ovo Modell Systeme17 entfällt induzieren Diabetes durch die Streptozocin (STZ) Behandlung, wie wir Embryonen am Tag 10 oder 11 der Inkubation zu verwenden. In diesem Stadium Insulin-Produktion hat noch nicht begonnen, aber die Embryonen sind bereits Insulin empfindlich. Darüber hinaus kann Erlaubnis von einer Ethikkommission erforderlich sein, wenn Embryonen im Alter von 14-17 Tagen verwendeten17sind. Darüber hinaus ist im Vergleich zu alternativen Strategien18, die zusammengesetzte Anwendung wie hier beschrieben weniger schädlich und mühsam, Erhöhung experimentelle Durchsatz.
Zusammen genommen, diese in Ovo ist Ansatz ein attraktives System, wenn eine Blut-abnehmender Wirkung einer Insulin-mimetische Substanz muss in einem lebenden Organismus getestet werden.

Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie gekennzeichnet und wird durch defekte Insulinsekretion oder Insulin Aktion1verursacht. Neunzig Prozent aller Diabetesfälle sind Kategorie Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), wo Einzelpersonen zu demonstrieren, Insulin-Resistenz und vor allem Insulin-Mangel2. Mehrere Faktoren sind dafür bekannt, die globale Inzidenz von T2DM, einschließlich Veränderungen im Lebensstil, insbesondere die Überernährung, Altern und Bewegungsmangel erhöhen. Rund 400 Millionen Menschen haben Diabetes Mellitus nach der International Diabetes Federation (IDF) weltweit. Diese Zahl wird voraussichtlich 600 Millionen innerhalb der nächsten 20 Jahre3zu erreichen.
Diabetische Komplikationen verursacht durch Hyperglykämie und Insulinresistenz, wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen, Glukoseintoleranz, koronare Herzkrankheit und zerebralen Gefäßerkrankungen, führen zu einer deutlich reduzierten Lebenserwartung und Qualität4. Betroffenen Personen erfordern Glukose-senkenden Pharmakotherapie; Allerdings ist die Verwendung von Drogen wie Metformin5 oft verbunden mit dramatischen Nebenwirkungen6,7,8. Daher sind weitere Antidiabetika Ansätze, die sicher, weithin verfügbar und kostengünstig sind erforderlich.
Verschiedene pflanzliche Verbindungen, Extrakte, Pflanzen und Nutraceuticals sind Feature-Insulin-mimetischen Eigenschaften zugeschrieben worden, durch die Modulation verschiedene Zellfunktionen. Ein wichtiges Merkmal ist die Stimulation der die Translokation von glukosetransporters 4 (GLUT4) an der Plasmamembran von intrazellulären Staufächer, wodurch eine erhöhte Aufnahme von Glucose in Muskel und Fettgewebe in Abwesenheit von Insulin, bekannt als Insulin-mimetischen Eigenschaften9. Zuvor haben wir einen Fluoreszenz-Mikroskopie-basierter Ansatz zur Quantifizierung des Translokation Prozess von GLUT410implementiert. Analyse der zahlreichen Pflanzenextrakte aus Extrakt Bibliothek11 mit dieser Assay führte bei der Identifizierung von vielversprechenden Kandidaten. Weitere Tests in lebenden Organismen sind jedoch erforderlich. In diesem Papier, eine modifizierte Küken Embryos Modell ausführlich beschriebene Ansatz erweist sich ein zukunftsträchtiges Modell zur Identifizierung von Substanzen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften. Es stellt ein attraktives Instrument, die große Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Studien und bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Systemen wie akzeptablen Kosten, einfache Handhabung und angemessene Durchsatzraten. Darüber hinaus ist die Berechtigung von einer Ethikkommission nicht erforderlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">Biochrom</td>
			<td style="width:123px;">L1825</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovoRapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>8-0905-82-304-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td>
			<td>Local Breeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check performa</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check Inform II Teststreifen</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>5942861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator&#160; HEKA- Turbo 288</td>
			<td>HEKA Brutger&#228;te</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe Omnican F 1 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>09161502S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracts</td>
			<td>PEKISH extract library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp Tempo Nr. 119</td>
			<td>ORBAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

Erhöhte Blutzuckerwerte bei Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM), eine komplexe und multifaktorielle Stoffwechselerkrankung werden durch Insulin-Resistenz und β-Zellen Ausfall verursacht. Verschiedene Strategien, einschließlich die Injektion von Insulin oder die Verwendung von Insulin-sensibilisierende Medikamente wurden fortgesetzt, um T2DM zu behandeln oder zumindest die Symptome zu reduzieren. Darüber hinaus hat die Anwendung von pflanzlichen Verbindungen immer mehr Aufmerksamkeit erregt. Daher ist es notwendig, effiziente Testsysteme zu identifizieren und zu charakterisieren, Insulin-mimetischen Verbindungen zu finden. Hier haben wir eine modifizierte Küken Embryos Modell, das ermöglicht das Testen der synthetischen Verbindungen und Kräuterextrakte mit Insulin-mimetischen Eigenschaften entwickelt. Mit einer Fluoreszenz Mikroskopie-basierten primären Bildschirm, der die Translokation von glukosetransporters 4 (Glut4) an der Plasmamembran quantifiziert, konnten wir Verbindungen, vor allem pflanzliche Extrakte zu identifizieren, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Glukose führen Konzentrationen in Adipozyten. Die Wirksamkeit dieser Substanzen erfordert jedoch weitere Überprüfung in einem lebenden Organismus. So haben wir in Ovo Ansatz, um deren Blut Glukose-reduzierenden Eigenschaften zu identifizieren. Die Zulassung durch eine Ethik-Kommission ist nicht erforderlich, da die Verwendung von Hühnerembryos während der ersten zwei Drittel der Embryonalentwicklung keinen Tierversuch angesehen wird. Hier wird die Anwendung dieses Modells im Detail beschrieben.

Beschreibung des Gluc-HET-Ansatzes:
Nach der Inkubation mit den Stoffen von Interesse die befruchteten Eizellen geöffnet und bereit für die Blutentnahme durch Beseitigung der Eierschale (Abbildung 2). Weitere Vorbereitung umfasst Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran für den Zugriff auf die chorioallantoic Membrane. Diese Membran ist dann sorgfältig geschnitten, um Zugang zu einem geeigneten Blutgefäß zur Blutentnahme. Vorzugsweise ist das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos auf Kunststoff pH-Streifen gelegt. Zur Verdünnung des Blutes während der Erfassung zu vermeiden, ist das Schiff und pH-Streifen klopfte trocken mit Filterpapier. Das Blutgefäß wird dann geschnitten und Blut austritt auf die pH-Streifen ist für die Analyse mit einer Pipette gesammelt.
Auswirkungen auf den Blutzuckerspiegel ausgewählte Kräuterextrakte:
Mit einem kürzlich ins Leben gerufene GLUT4-Translokation Quantifizierung-basierten primären Bildschirm sind wir in der Lage, Stoffe zu identifizieren, mit einem Insulin-mimetischen charakteristischen10. Screening von Hunderten von wasserlöslichen Kräuterextrakte führte bei der Identifizierung von mehreren Treffern. Diese Extrakte wurden in unserem in -Ovo Modell getestet. Für diese Experimente wurden Auszüge aus Combretum Indicum (Rangoon Creeper) vorbereitet und ein nicht offengelegt-Extrakt (Extrakt 0845 bezeichnet) verwendet. Wir aufgelöst die Extrakte in HBSS Puffer bei 300 mg/L, eine Konzentration, die in früheren Studien12,13geeignet herausstellte. Auf die Embryonen für 11 Tage inkubiert wurden Substanzen angewendet. Wie in Abbildung 3gezeigt, hat der Extrakt aus Rangoon Creeper keine bedeutende Blut Glukose Reduktion in Ovogeführt. Jedoch wurde die Blut-Glukose-Konzentration erfolgreich reduziert mit Extrakt 0845, mit einer geringfügigen Abnahme nach 60 min, das ist vergleichbar mit der Wirkung, die mit einem im Handel erhältlichen Insulin analoge beobachtet. Eine signifikante Wirkung wurde beobachtet, wenn die Inkubationszeit der Eier verlängert wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Abbildung 1: Einfluss von toxischen Verbindungen auf Embryo Vitalität. Eiern inkubiert für 11 Tage (A und C) oder mit einer giftigen Kräuterextrakt am Tag 10 für ein weiteres 24 h behandelt wurden (B und D). Anwendung des Extrakts führte zu schweren Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane (D) und der Embryo (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Abbildung 2: Beschreibung des Modells in Ovo . Von links nach rechts: Eröffnung und Entfernung der Eierschale (1-2); Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran mit chorioallantoic Membrane ausgesetzt sind (3); vorbereitete Gefäß auf einem pH-Streifen (4); die Gewinnung von Blut und Messung der Glukosekonzentration unter Verwendung einer Glukose Meter (5). Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Abbildung 3: Wirkung von Kräuter-Extrakten auf den Blutzuckerspiegel im Vergleich zu unbehandelten oder Insulin-behandelten Eiern. Eiern waren für 11 Tage inkubiert und mit den angegebenen Substanzen behandelt (im Handel erhältlichen Insulin analoge: 3,3 U/mL; Extrakte: 300 mg/L) aufgelöst in HBSS Puffer (300 µL Volumen) für bis zu 3 h Blut Blutzuckerspiegel über ein Blutzuckermessgerät ermittelt wurden. Ergebnisse werden ohne die Wirkung des Puffers angezeigt. Fehlerindikatoren basieren auf den Standardfehler des Mittelwerts. * P < 0,05 und *** P < 0,0001, bedeutende Abnahme in Bezug auf HBSS-behandelten Eiern der Inkubation gleichzeitig. Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Aufrufe.  University of Applied Sciences Upper Austria. In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.

Serie: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Forschung

Neurowissenschaften

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Ein präklinisches Modell zur Beurteilung der Gehirnerholung nach akutem Schlaganfall bei Ratten

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...