Dieses Protokoll beschreibt einige Methoden zur Quantifizierung der Lipidtröpfchenbildung bei menschlichen Darmorganoiden. Es kann als Eine High-Throughput-Screening-Plattform verwendet werden, um auf Medikamente zu testen, die Lipid-Tröpfchenbildung modulieren. Die Von uns beschriebene Methode basiert auf einem Lipidtropfen-spezifischen Farbstoff und biopsieabgeleiteten Darmorganoiden.
Es bietet damit ein stabiles, genaues und physiologisch relevantes Modell für die Lipidtröpfchenbildung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um patientenspezifische neuartige Arzneimittelkandidaten zu überprüfen, die die Bildung von Lipidtröpfchen modulieren, z. B. bei DGAT1-patienten. Diese Lipid-Tröpfchen-Bildung Assay kann auch auf andere Arten von organoiden Kulturen angewendet werden, um Lipidstoffwechsel in anderen Zelltypen zu studieren.
Der Assay ist in erheblichem Maße von der Dichte der Organoidkultur abhängig. Versuchen Sie, eine konsistente Organoiddichte über Proben und Experimente hinweg zu gewährleisten. Visuelle Demonstration dieses Assays ist wichtig, weil es wichtig ist, zu zeigen, wie das Organoid kultiviert werden sollte und wie sie behandelt werden sollten, um eine ordnungsgemäße Analyse der Lipidtröpfchenbildung zu gewährleisten.
Nach der Vorbereitung der Organoide, saugen Sie vorsichtig das Kulturmedium, ohne die Tröpfchen der Kellermembranmatrix zu stören. Fügen Sie 500 Mikroliter kaltes Basalmedium zum ersten Brunnen von Organoiden hinzu. Mit einer P1000 Pipette, sanft Pipette nach oben und unten, um die Keller Membran Matrix Tröpfchen mit Organoiden zu stören.
Wiederholen Sie diese Verfahren mit dem gleichen Medium im nächsten gut wie erforderlich, aber ernten Sie nicht mehr als zwei Brunnen pro 500 Mikroliter Basalmedium. Sammeln Sie die Organoide in einem niedrig bindenden 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie sie 15 bis 20 Sekunden lang in einer Mini-Tischzentrifuge nach unten. Fügen Sie 400 Mikroliter Trypsin zu den gesponnenen Organoiden hinzu.
In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie als Nächstes eine P200-Pipette, um die Suspension vorsichtig nach oben und unten zu pipetten, um die verbleibenden Aggregate der Zellen zu stören. In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.
Wenn nur noch einzelne Zellen übrig sind, fügen Sie einen Milliliter Basalmedium hinzu, und drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 Sekunden herunter. Aspirieren Sie den Überstand vollständig. Verwenden Sie eine P200 Pipetten, um die einzelnen Zellen in 200 Mikrolitern frischer hSI-EM wieder aufzuhängen, und fügen Sie weitere 800 Mikroliter hSI-EM hinzu.
Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen in der Suspension und berechnen Sie das Volumen der Zellen, die für die endgültige Zelldichte benötigt werden. Nehmen Sie das entsprechende Suspensionsvolumen heraus und passen Sie die Dichte auf 750 Zellen pro Mikroliter an. Fügen Sie der Zellsuspension eine Kellermembranmatrix im Verhältnis von zwei zu eins hinzu.
Sanft Pipette die Suspension zu mischen, vorsichtig zu vermeiden, Blasen zu vermeiden. In einer vorgewärmten Kulturplatte drei 10-Mikroliter-Tröpfchen pro Brunnen aussäen, wenn die Platte 24 Brunnen oder ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen pro Brunnen hat, wenn die Platte 96 Brunnen hat. Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 10 bis 15 Minuten, um die Tröpfchen zu erstarren.
In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius ein entsprechendes Volumen von hSI-EM+Y vorwärmen. Danach den vorgewärmten hSI-EM+Y vorsichtig in jeden Brunnen der Platte geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.
Ersetzen Sie das Medium nach zwei bis drei Tagen durch hSI-EM und aktualisieren Sie es zwei- bis dreimal pro Woche. Erstens, wiegen Sie 0,2 Gramm flüssige Ölsäure bei Raumtemperatur. 1,5 Milliliter kulturtaugliches steriles PBS hinzufügen und das Gemisch eine Stunde lang auf 70 Grad Celsius erhitzen und dafür sorgen, dass es zeitweise vorstößt.
Als nächstes wiegen Sie 5,89 Gramm fettsäurefreie BSA und lösen Sie sie in 33,9 Milliliter PBS auf. Erwärmen Sie die Mischung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, bis die BSA vollständig aufgelöst ist. Die Ölsäuremischung wieder zu einer Emulsion feiner Tröpfchen zu versenken und sofort mit einer Glaspipette in die BSA-Lösung einzubauen.
Halten Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, bis eine klare gelbliche Lösung bleibt. Durchgehen sie die Organoide, wie zuvor beschrieben, und säen Sie die organoiden Einzelzellen in eine schwarze Klarbodenplatte 96-Well aus. Ersetzen Sie am sechsten Tag der Kultivierung auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM, das einen Millimolar der Ölsäure und des BSA-Konjugats enthält.
Inkubieren Sie die Zellen für 16 bis 17 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 mikromolaren DGAT1-Inhibitoren. Danach das Medium ansaugen, ohne die Kellermembran-Matrixtröpfchen zu stören. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie 100 Mikroliter von vier Prozent neutral gepuffertem Formaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur in die Brunnen einfügen.
Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 150 Mikroliter PBS pro Brunnen. Stain die Zellen für Lipidtröpfchen mit 025 Milligramm pro Milliliter LD540 und DAPI in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dann waschen Sie die Brunnen sorgfältig mit PBS.
Für Übersichtsbilder ganzer Organoide wird ein 40-fach subjektives verwendet, das für konfokale Fluoreszenzaufnahmen geeignet ist. Stellen Sie das Mikroskop auf ein Bild für DAPI und den LD540-Farbstoff mithilfe der hier gezeigten Anregungs- und Emissionseinstellungen ein. Stellen Sie die Lochgröße auf eine luftige Einheit für eine ausreichende Z-Achsen-Auflösung ein.
Um die Hälfte eines kugelförmigen Organoids abzubilden, stellen Sie einen Z-Stack auf ca. 85 Mikrometer ein. Verwandeln Sie mithilfe eines geeigneten Bildverarbeitungssystems den Z-Stack jedes Organoids in eine maximale Projektion, indem Sie auf Bild, Stapel, Z-Projekt klicken. Legen Sie den Schwellenwert für die maximale Projektion auf einen Wert fest, in dem kein LD540-Signal in der BSA-Fahrzeugsteuerungsstichprobe sichtbar ist, indem Sie auf Bild, Anpassen, Schwellenwert klicken.
Verwenden Sie diese Einstellungen, um jedes Bild zu beschumen. Messen Sie dann die Gesamtfluoreszenzfläche für jede maximale Projektion mit der Funktion Analysieren, Partikel analysieren. Für eine ordnungsgemäße Analyse der Lipidtröpfchenbildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit Ölsäure und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden.
Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Nach der Stimulation mit einem Millimolar Ölsäure über Nacht kann die Lipidtröpfchenbildung mit einem invertierten Hellfeldmikroskop visualisiert werden. Die Ansammlung von Lipidtröpfchen streut das übertragene Licht, und daher erscheinen die Organoide dunkler, während nicht stimulierte Organoide ein durchscheinendes Aussehen haben.
Sobald die Ölsäure-stimulierten Organoide fixiert und gebeizt sind, kann die Lipidtröpfchenbildung mit einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Da es sich bei den Organoiden um 3D-Strukturen handelt, ist ein regelmäßiges Epifluoreszenzmikroskop aufgrund des außerfokussierten Hintergrundsignals nicht geeignet, so dass ein konfokaler Z-Stack verwendet wird, um LDF in Organoiden zu charakterisieren. Die Quantifizierung der konfokalen Mikroskopieproben kann auch mit einem auf das fluoreszierende Hoechst-Signal normalisierten Fluoreszenzplattenleser durchgeführt werden.
Der Plattenleser-Assay zeigt eine signifikante Abnahme des LD540-Signals in Organoidzellen, die mit DGAT1-Hemmer behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Organoiden. Die Quantifizierung der LD-Bildung in einzelnen Zellen kann mit einem Durchflusszytometer erreicht werden. Die hier gezeigte Gating-Strategie ist für dissoziierte menschliche Darmorganoide.
Repräsentative Histogramme sowohl für das SSC-A als auch für das LD540-Signal der letzten Lebenden Zellpopulation zeigen, dass die Lipidtröpfchenbildung aufgrund der Bildung von intrazellulären Lipidtröpfchen zu einer Zunahme von SSC-A führen wird. Darüber hinaus LD540 Flecken für Lipide, die in den Lipidtröpfchen gespeichert sind, und das Signal wird auch auf die Induktion der Lipidtröpfchen Bildung erhöhen. Als solche wird die Lipidtröpfchenbildung als Verschiebung der mittleren fluoreszierenden Intensität von SSC-A und LD540 gemessen.
Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die Kultur der menschlichen Darmorganoide und die richtige Wellung von Ölsäure zu BSA. Um mehr Bedingungen zu erfüllen, kann dieser Test mit einem Fluoreszenzplattenleser analysiert werden. Um die Organoidzahl pro Bohrwert zu korrigieren, wurde das LD540-Signal auf das DAPI-Signal normalisiert.
Mit dieser Technik können Forscher die Lipidtröpfchenbildung in Organoidsystemen untersuchen und verschiedene Analysetechniken wie die Elektronenmikroskopie verbessern, um ihre Ergebnisse zu validieren.
