Mit dem Ziel, die Integrität der Darmbarriere zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt, um die Integrität der Darmbarriere bei kleinen Darmorganoiden der Maus zu messen. Im Gegensatz dazu beziehen wir uns auf die verwendete monolayer Zellkultur, unser Assay basiert auf dreidimensionalen kleinen Darmorganoiden. Die Anpassung eines zweidimensionalen Assays an unser Modell war für seine Praktikabilität unerlässlich.
Der Assay basiert auf Organoiden kultiviert in vitro und seine Anwendung wird dazu beitragen, Induktoren und Inhibitoren der Darmbarriere Integrität zu definieren. Die Regulierung von engen Knotenproteinen ist ein wichtiges Merkmal aller Epithelzellen. Unser Assay ermöglicht die Funktion und Analyse der Epithelbarriereintegrität.
Um die Barriereintegrität von Organoiden zu messen, die aus dem Darmgewebe der Maus isoliert sind, müssen zunächst alle Zentrifugationsröhren, die für die Lagerung der Organoide während des Beschichtungsprozesses verwendet werden, mit genügend 0,1%BSA in PBS vorlacken, um alle Kunststoffoberflächen abzudecken. Entfernen Sie sofort die BSA-Lösung und legen Sie die Rohre auf Eis. Als nächstes tauen Sie die Zellmatrixlösung und das Organoidkulturmedium auf Eis auf und entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium aus jedem Brunnen einer 48 gut organoiden Kulturplatte.
Waschen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter kalten PBS, bevor Sie kräftig Pipettieren, um die Zellmatrizen aufzulösen. Wenn relativ homogene Zellsuspensionen erhalten wurden, waschen Sie die Organoide zweimal durch Zentrifugation mit frischem PBS und setzen Sie jede Organoidkultur in 40 Mikroliter kaltem Medium wieder auf. Dissoziieren Sie die großen organoiden Strukturen durch eine 10 Mikroliter Pipettenspitze fünfmal, um Strukturen mit einer Größe von 40 bis 60 Mikrometern zu sammeln und jede organoide Suspension mit 40 Mikroliter frisch zubereiteter Zellmatrixlösung zu mischen.
Fügen Sie jede organische Zellmatrixlösung Suspension in die Mitte der einzelnen Brunnen eines acht gut kammerförmigen Deckelrutsch und legen Sie die Rutsche auf einem Eispack für fünf Minuten. Am Ende der Inkubation stellen Sie die Rutsche 20 Minuten lang auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um eine Polymerisation der organoiden Zellmatrixstruktur zu ermöglichen, bevor Sie jedem Brunnen 150 Mikroliter Organiderkulturmedium für eine 24-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator hinzufügen. Behandeln Sie am Ende der Inkubation die Positivkontrollbrunnen mit 10 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem murinen Interferon-Gamma 48 Stunden lang.
Um einen Permeabilitätstest durchzuführen, übertragen Sie den kammerförmigen Deckelschlupf in die 37 Grad Celsius erwärmte Inkubationskammer eines invertierten konfokalen Mikroskops und stellen Sie das Kohlendioxid der Kammer auf 5%, verriegeln Sie den Deckelrutsch fest auf die Mikroskopstufe und passen Sie die bildgebenden Einstellungen des Mikroskops an, um die Organoide in einem Brunnen der Kammer zu visualisieren. Dann fügen Sie drei Mikroliter frisch zubereitet100 Millimolar Luzifer gelb in 150 Mikroliter Medium zu einem Brunnen für eine Stunde Inkubation in der Mikroskopkammer. Passen Sie am Ende der Inkubation den Fokus an, um das Lumen des Referenzorganoids zu visualisieren und die benötigte Laserenergie für die luzifergelbe Anregung und die jeweilige Erkennungsempfindlichkeit des Instruments zu definieren, um das Luzifergelbe Signal bei 30 bis 40% des verfügbaren Dynamikbereichs des Instruments abzubilden.
Alternativ kann die Signalintensität durch Änderung der Belichtungszeit geändert werden. Die Positionen von etwa 10 Organoiden mit einer sphärischen Struktur in der Nähe der Deckslipoberfläche pro Brunnen durch Differentialinterferenz kontrastieren Live-Bildgebung zu finden, Organoide mit vergleichbaren Durchmessern zu erfassen und sich auf die zentrale Scheibe der Organoide zu konzentrieren, um die Lumen abzubilden. Zeichnen Sie den Differentialinterferenzkontrast und die luzifergelbe Fluoreszenz jeder Position auf, um die Form und Autofluoreszenz jedes Organoids zu dokumentieren.
Wenn alle Organoide abgebildet sind, fügen Sie 150 Mikroliter Medium, einschließlich Luzifergelb, zu den Luzifer gelben Behandlungsbrunnen hinzu und stellen Sie alle fünf Minuten für 70 Minuten alle Brunnen ab. Am Ende der Bildgebungssitzung vier Mikroliter frisch zubereiteten EGTA auf 100 Mikroliter Medium hinzufügen. Fügen Sie den verdünnten EGTA in die entsprechenden Brunnen.
Dann nehmen Sie die Fluoreszenz der Organoide in jedem Brunnen alle fünf Minuten für 30 Minuten auf. Achten Sie darauf, die Handhabung und Kultur oder Organoide im Voraus zu üben, da zelluläre Lebensfähigkeit und Integrität eine Voraussetzung für den Erfolg des Assays sind. In diesem repräsentativen Experiment war nach 70 Minuten Behandlung mit Luzifer gelber luzifergelber Fluoreszenz nur bei Organoiden von Wildtieren sichtbar, die mit Interferon-Gamma behandelt wurden.
Weder unstimulierte Kontrollen, noch Organoide, die von Interferon-Gamma-Rezeptor-2-Knockout-Tieren abgeleitet wurden, zeigten am Ende der Behandlungsperiode intraluminal Lucifer gelbe Fluoreszenz. Die Zugabe von EGTA verursachte einen unspezifischen Zusammenbruch der Darmbarriereintegrität durch die Sequestrierung enger Kreuzungskofaktoren, was zu luzifergelber Aufnahme und Expression in allen Organoiden unabhängig von Herkunft oder Behandlungsbedingungen führte. Die relativen Intensitätswerte für den luzifergelben Fluoreszenzspiegel innerhalb des organoiden Lumens und außerhalb jedes Organoids können ebenfalls quantifiziert werden.
Achten Sie darauf, Organoide mit einer vergleichbaren Größe um die Konfiguration zu wählen und die eingestellte Achse auszuwählen, so dass Sie sich das zentrale Lumen des Organoids vorstellen können. Neben der Verwendung von Substanzen, die den Abbau von Darmbarrieren induzieren, können wir auch Strategien zur Hemmung der Zerstörung von Darmbarrieren untersuchen. Da diese Methode auf Primärzellen eines einzelnen Tieres basiert, kann sie für viele Assays verwendet werden, wodurch die Anzahl der für jedes Experiment benötigten Tiere reduziert wird.
