이 프로토콜은 인간 장 가내장에 있는 지질 물방울 대형을 정량화하는 몇몇 방법을 기술합니다. 지질 방울 형성을 조절하는 약물을 테스트하기 위해 고처리량 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 우리가 설명하는 방법은 지질 물방울 특정 염료 및 생검 유래 장 가내장에 근거를 두고 있습니다.
이를 통해 지질 방울 형성을 위한 안정적이고 정확하며 생리학적으로 관련된 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 DGAT1 결핍 환자에서 지질 방울 형성을 조절하는 환자 특정 새로운 약물 후보를 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 지질 액적 형성 분석또한 다른 세포 모형에 있는 지질 대사를 공부하기 위하여 오르가노이드 배양의 그밖 모형에 적용될 수 있습니다.
분석은 오르가노이드 배양의 밀도에 크게 의존한다. 샘플 및 실험 전반에 걸쳐 일관된 오르간성 밀도를 확인하십시오. 이 분석법의 시각적 데모는 오르가노이드가 어떻게 배양되어야 하는지, 지질 방울 형성의 적절한 분석을 보장하기 위해 어떻게 처리되어야 하는지 를 보여주는 것이 중요하기 때문에 중요합니다.
오가노이드를 준비한 후, 지하 막 매트릭스의 액적을 방해하지 않고 배양 배지를 조심스럽게 흡인한다. 오가노이드의 첫 번째 우물에 차가운 기저 배지 500 마이크로 리터를 추가합니다. P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드로 지하 막 매트릭스 방울을 부드럽게 피펫으로 막습니다.
다음 뿐만 아니라 필요에 동일한 배지와 함께이 절차를 반복 하지만 기저 배지의 500 마이크로 리터 당 두 개 이상의 우물을 수확 하지 않습니다. 구속력이 낮은 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 오르가노이드를 수집하고 15~20초 동안 미니 탁상 원심분리기에서 회전합니다. 스펀 다운 오르가노이드에 트립신 400 마이크로 리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 5분간 수조에 배양하세요. 다음으로 P200 파이펫을 사용하여 서스펜션을 위아래로 부드럽게 피펫하여 나머지 셀 응집체를 방해합니다. 섭씨 37도에서 5분간 수조에 배양하세요.
단일 셀만 남아 있을 때, 기초 매체의 1 밀리리터를 추가하고, 15~20초 동안 미니 탁상 원심분리기에서 셀을 아래로 회전시합니다. 슈퍼 네티퍼를 완전히 흡인. P200 파이펫을 사용하여 신선한 hSI-EM의 200 마이크로리터에서 단일 세포를 다시 중단하고 hSI-EM의 800 마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 현탁액의 세포 수를 계산하고 최종 세포 밀도에 필요한 셀의 부피를 계산합니다. 현탁액의 적절한 볼륨을 꺼내 마이크로 리터 당 750 세포로 밀도를 조정합니다. 2 대 1의 비율로 세포 현탁액에 지하 막 매트릭스를 추가합니다.
거품을 만들지 않도록 주의하여 현탁액을 부드럽게 피펫합니다. 미리 데운 배양 플레이트에서 접시에 96개의 우물이 있는 경우 플레이트에 우물 24개 또는 5마이크로리터 방울 1개가 있는 경우 잘 하면 10마이크로리터 방울 3개를 잘 파종합니다. 접시를 섭씨 37도에 놓고 5%의 이산화탄소를 10~15분 동안 배치하여 물방울을 고화시합니다.
한편, 섭씨 37도의 수조에서 적절한 양의 hSI-EM+Y를 미리 따뜻하게 합니다. 이 후, 조심스럽게 플레이트의 각 우물에 미리 따뜻하게 hSI-EM + Y를 추가합니다. 37도에서 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다.
2~3일 후에는 미디어를 hSI-EM으로 교체하고 일주일에 2~3회 새로 고치십시오. 첫째, 실온에서 액체 올레산의 0.2 그램의 무게. 배양등급 멸균 PBS 1.5밀리리터를 넣고 혼합물을 1시간 동안 섭씨 70도로 가열하여 간헐적으로 소용돌이를 피하십시오.
다음으로, 무게 5.89 지방산 무료 BSA의 그램 과 PBS의 33.9 밀리리터에 용해. BSA가 완전히 용해 될 때까지 37섭씨에서 수조에 혼합물을 데우습니다. 올레산 혼합물을 다시 소용돌이시켜 미세 한 방울의 에멀젼을 생성하고 유리 파이펫을 사용하여 즉시 BSA 용액에 추가합니다.
맑은 황색 용액이 남아있을 때까지 30 분 동안 37도에서 혼합물을 유지합니다. 이전에 설명된 대로 오르가노이드를 통과하고 오르가노이드 유래 단일 세포를 검정 투명 하부 96-웰 플레이트로 시드한다. hSI-EM에서 배양6일째에 배양 배지를 올레산 과 BSA 컨쥬게이트의 1밀리머를 함유한 hSI-EM으로 대체한다.
0.1 마이크로몰러 DGAT1 억제제의 존재 또는 부재에서 섭씨 37도에서 16~ 17시간 동안 세포를 배양한다. 그 후, 지하 막 매트릭스 방울을 방해하지 않고 배지를 흡인한다. 4% 중성 버퍼링 포름알데히드의 100 마이크로리터를 실온에서 30분 동안 우물에 추가하여 오르가노이드를 고정시하십시오.
포름알데히드를 부드럽게 제거하고 우물당 150 마이크로리터의 PBS로 세포를 조심스럽게 씻으십시오. 밀리리터 LD540당 025 밀리그램, PBS의 DAPI를 어두운 실온에서 15분 동안 으로 염색합니다. 그런 다음 PBS로 우물을 조심스럽게 씻으시다.
전체 오르가노이드의 개요 이미지는 공초점 형광 화상 진찰에 적합한 40X 주관적인 것을 사용합니다. 여기에 표시된 여기저기 및 방출 설정을 사용하여 DAPI 및 LD540 염료에 대한 이미지로 현미경을 설정합니다. 핀홀 크기를 충분한 z축 해상도를 위해 하나의 통풍이 잘 되는 단위로 설정합니다.
구형 오르가노이드의 절반을 이미지화하기 위해 z 스택을 약 85 마이크로미터로 설정합니다. 적절한 이미지 처리 시스템을 사용하여 이미지, 스택, Z 프로젝트를 클릭하여 각 오르간노이드의 z 스택을 최대 프로젝션으로 변환합니다. 이미지, 조정, 임계값을 클릭하여 BSA 차량 제어 샘플에 LD540 신호가 표시되지 않는 수준으로 최대 투영의 임계값을 설정합니다.
이러한 설정을 사용하여 각 이미지의 임계값을 설정합니다. 그런 다음 함수를 사용하여 각 최대 투영에 대한 형광의 총 면적을 측정하여 입자를 분석합니다. 지질 방울 형성의 적절 한 분석을 위해, 오르가노이드는 올레산과 후속 염색으로 자극하기 전에 너무 조밀하게 씨를 뿌려서는 안됩니다.
이것은 겹치는 오르가노이드가 형광을 방해 할 수 있기 때문에 공초점 및 플레이트 리더 판독에 특히 중요합니다. 하룻밤 동안 올레산 1 밀리머로 자극 한 후, 지질 방울 형성은 반전 밝은 필드 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 지질 방울의 축적은 빛을 산란시키고, 따라서 오르가노이드는 더 어둡게 보이지만 비 자극된 오르가노이드는 반투명 한 외관을 가지고 있습니다.
올레산 자극 가이오노이드가 고정되고 염색되면, 지질 방울 형성은 공초점 현미경을 사용하여 시각화될 수 있다. 오르가노이드는 3D 구조이므로, 정기적인 상피성 현미경은 초점이 아닌 배경 신호로 인해 적합하지 않으므로 공초점 z 스택이 오르가노이드에서 LDF를 특성화하는 데 사용됩니다. 공초점 현미경 시료의 정량화는 또한 형광회회시 신호로 정규화된 형광판 판독기를 이용하여 수행될 수 있다.
플레이트 판독기 분석은 치료되지 않은 유기체에 비해 DGAT1 억제제로 처리된 오르가노이드 세포에서 LD540 신호의 현저한 감소를 나타낸다. 개별 세포에서 LD 형성의 정량화는 유동 세포계를 사용하여 달성될 수 있다. 여기에 표시된 게이팅 전략은 해리 된 인간 장 오르가노이드입니다.
최종 살아있는 세포 집단의 SSC-A와 LD540 신호 모두에 대한 대표적인 히스토그램은 지질 방울 형성으로 인해 세포 내 지질 물방울의 형성으로 인해 SSC-A의 증가를 초래할 것이라는 점을 보여줍니다. 또한, 지질 방울에 저장된 지질에 대한 LD540 얼룩, 그리고 신호는 또한 지질 방울 형성의 유도에 따라 증가할 것이다. 이와 같이, 지질 액적 형성은 SSC-A와 LD540 모두의 평균 형광 강도의 변화로 측정된다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 인간 장 기관가노이드의 문화와 BSA에 올레산의 적절한 골판지입니다. 더 많은 조건을 수용하기 위해 이 분석은 형광판 판독기를 사용하여 분석할 수 있습니다. 잘 당 오르간 수를 보정하기 위해 LD540 신호는 DAPI 신호로 정규화되었다.
이 기술을 통해 연구자들은 오르가노이드 시스템의 지질 적물 형성을 연구하고 전자 현미경 검사법과 같은 다양한 분석 기술을 개선하여 연구 결과를 검증할 수 있습니다.
