Die direkte Messung von Wasser, Proteinen und Lipiden mit Tiefenauflösung bei Menschen ist sehr wichtig für hautbedingte Erkrankungen, für die Charakterisierung der Leistung von Hautpflegeprodukten. Diese Methode nutzt zusammen mit der anschließenden Analyse Chemometrie, um chemische Informationen zu extrahieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der klinische Raman-Datensatz von geschulten Instrumentenbedienern gesammelt werden kann, denen es an technischem Know-how fehlt, um alle Quellen spektroskopischer Artefakte zu identifizieren, auszuschließen und zu beheben.
Der resultierende Datensatz kann dann verarbeitet werden, um Ausreißer zu identifizieren, die aus dem Datum vor der Analyse ausgeschlossen werden müssen. Eine zentrale Herausforderung bei der Datenanalyse ist das Entfernen der Ausreißer und die Identifizierung der Anzahl der Schlüsselkomponenten im Datensatz. Der Ansatz zeigt in diesem Video, dass Vorkenntnisse über den klinischen Datensatz und den Chemometrie-Ansatz genutzt werden, um Wasser, Protein und Lipid mit Tiefenauflösung erfolgreich zu extrahieren.
Demonstriert wird das Verfahren von Li Yang, Techniker aus unserem C&T-Labor. Lassen Sie den Gegenstand zunächst eine markierte Läsionskörperstelle oder Kontrollstelle in engem Kontakt mit dem bildgebenden Fenster des in vivo konfokalen Raman-Instruments platzieren. Achten Sie darauf, dass sie das gesamte Fenster abdecken, um die Auswirkungen von Raumlicht auf die Bildgebung zu vermeiden.
Öffnen Sie dann die Software und verschieben Sie den Fokus, bis ein Spektrum ähnlich dem hier gezeigten zu sehen ist. Danach bewegen Sie den Fokus 10 Mikrometer von der Hautoberfläche weg. Sammeln Sie Daten für 26 Schritte mit einer Zwei-Mikron-Schrittgröße in dem hier gezeigten Frequenzbereich mit einer Belichtungszeit von einer Sekunde.
Messen Sie acht Replikationen für jeden Bereich, die insgesamt bis zu 15 Minuten dauern. Verwenden Sie zunächst das Befehlsfenster und MATLAB, um die Dateierweiterung der gesammelten Daten von ric in mat zu ändern. Laden Sie dann die Mattendatei auf die MATLAB-Softwareplattform, wie hier gezeigt.
Korrigieren Sie die Basislinie des Datensatzes mit der Methode der automatischen gewichteten kleinsten Quadrate, indem Sie in das PLS_Workspace-Fenster gehen und mit der rechten Maustaste auf den importierten Datensatz klicken, zu Analysieren scrollen, Andere Tools auswählen und auf Vorverarbeitung klicken. Klicken Sie in dem Fenster, das angezeigt wird, auf Anzeigen. Scrollen Sie dann auf der Symbolleiste Verfügbare Methoden nach unten zur Filterung automatisch gewichteter Geleaster Quadrate, und wählen Sie Hinzufügen aus.
Klicken Sie als Nächstes auf OK, um die Optionen festzulegen und die Vorverarbeitung auf die Daten anzuwenden. Speichern Sie dies als Spectra_baseline. Kehren Sie als Nächstes zum Befehlsfenster zurück, und ersetzen Sie die Daten durch das korrigierte Basisergebnis.
Gehen Sie nun zum Texteditor und führen Sie das Programm wie hier gezeigt aus. Dadurch werden die Werte zwischen 2910 und 2965 inversen Zentimetern zusammengefasst, um die Intensitätswerte unter jedem Raman-Spektrum aus der Messung von 26 aufeinanderfolgenden Schritten zu erhalten und sie in einer Excel-Datei zu speichern. Wechseln Sie in MATLAB zum Arbeitsbereich, und legen Sie den Pfad für die Daten in Depth_save fest, wie gezeigt.
Verwenden Sie als Nächstes den hier beschriebenen Prozess, um den Instrumentenversatzwert von 26 bis 260 mithilfe der linspace-Funktion in MATLAB zu interpolieren. Dieser Prozess interpoliert den Intensitätswert von 26 bis 260 mithilfe der Spline-Methode und nutzt die neu generierten 260 Positionswerte. Darüber hinaus werden die 260 Positions- und Intensitätswerte als x- und y-Eingänge für die Polyfit-Funktion verwendet, wodurch der Gradwert auf 20 gesetzt wird.
Anschließend werden die Ausgangskoeffizienten und die 260 erweiterten Positionswerte als Eingang für Polyval verwendet, um die endgültigen 260 Intensitätswerte zu erhalten. Als Nächstes berechnet er die mittlere Intensität und findet den Punkt in der Kurve, der der mittleren Intensität am nächsten ist. Es wird auch den Tiefenwert entsprechend der Hautoberfläche ändern, in der bekannten Zwei-Mikron-Schrittgröße.
Führen Sie nun das Programm aus. Laden Sie den Raman-Spektren-Datensatz nach dem Entfernen der äußeren Hautspektren in die PLS_Toolbox-Software, unter der MATLAB-Plattform und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz, um Analysieren und dann PCA auszuwählen. Klicken Sie als Nächstes auf Vorverarbeitung auswählen.
Wählen Sie Normalisieren als Vorverarbeitungsansatz aus. Wählen Sie dann keine für die Kreuzvalidierung aus. Erstellen Sie dann das Modell unter Verwendung der drei Komponenten für die PCA-Zerlegungsanalyse.
Entfernen Sie nun die Abdeckung auf dem In-vivo-Fenster zur Sammlung von Ramen-Instrumenten, und erfassen Sie die Raumlichtspektren im Hochfrequenzbereich mit den gleichen Parametern, die für die Datensammlung des Referenzmaterials verwendet werden. Identifizieren Sie den Raumlichteffektfaktor durch Vergleich mit dem Raumlichthintergrund. Überprüfen Sie nun die Ergebnisse und entfernen Sie die Spektren mit dem deutlich höheren entsprechenden Score-Wert als normal.
Dies bedeutet, dass Score-Werte von mehr als 99,8 % des gesamten Datensatzes entfernt werden, was 0,16 in dieser Studie entspricht. Speichern Sie die resultierenden X-Block-Daten der Kalibrierung. Gehen Sie schließlich zum PLS_Workspace Browser und bearbeiten Sie die neue Datei.
Wählen Sie die Zeilenbeschriftungen aus, und gehen Sie zu Hard Delete Excluded, um die ausgeschlossenen Daten vor dem erneuten Speichern der Datei dauerhaft zu löschen. Beginnen Sie, indem Sie die Raman-Spektren-Baseline mit der gleichen gerade gezeigt korrigiert. Führen Sie als Nächstes die PCA-Analyse für den vorverarbeiteten Datensatz durch.
Zeichnen Sie die Eigenwerte in logarithmischer Skala zusammen mit der Anzahl der Komponenten, indem Sie auf die Schaltfläche Komponente auswählen klicken, und wählen Sie log(eigenvalues) als y-Wert aus. Um eine multivariate Kurvenauflösungsanalyse durchzuführen, verwenden Sie zunächst die Datenauswahltaste, um den Datensatz in die MCR_main-Software zu laden. Wählen Sie manuell die Anzahl der Komponenten aus, und legen Sie die Komponentennummer zwischen drei und acht fest.
Klicken Sie dann unter der Registerkarte Erste Schätzung auf die Schaltfläche Rein. Wählen Sie als Nächstes Konzentration aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Tun. Sobald der Bildschirm aktualisiert wird, klicken Sie auf die Schaltfläche Ok, und fahren Sie dann fort, um zur nächsten Seite zu wechseln.
Klicken Sie nun auf Weiter, und wenden Sie unter Implementierung fnnls an. Wählen Sie dann sechs aus dem Dropdown-Menü für die Anzahl der Arten mit Nicht-Negativitätsprofilen aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie auf der nächsten Seite dieselben Parameter aus, und klicken Sie auf Weiter.
Um die Position an der Hautoberfläche zu bestimmen, wurde der Bereich unter dem Raman-Peak des Proteins integriert, um das Tiefenprofil des Proteinsignals zu erhalten. Die Hautoberfläche wurde definiert als die Position, an der der Intensitätswert aus dem interpolierten Tiefenprofil der mittleren Intensität am nächsten kam. Die genaue Position der Hautoberfläche muss nicht mit einem experimentellen Datenpunkt übereinstimmen.
Insgesamt wurden 30 862 Raman-Spektren mit dem in diesem Video beschriebenen Datenerfassungsprotokoll gesammelt. Dieser große Spektraldatensatz enthält 20% Spektralausreißer. Die richtige Identifizierung und Entfernung der Ausreißerspektren ist wichtig, um einen korrekten Datensatz zu erreichen.
Hier kann man den Beitrag von Raumleuchten sehen, die auf einem Referenzspektren von Roomlight überlagert sind. Die Hauptkomponentenanalyse wurde für den vorverarbeiteten konfokalen Raman-Datensatz durchgeführt, und der Eigenwert wird zusammen mit der Anzahl der verwendeten Faktoren hier dargestellt. Für Faktor neun wurde ein signifikanter Rückgang des Eigenwertes beobachtet.
Diese Beobachtung schlägt vor, Modelle mit der Anzahl der Hauptkomponenten zu untersuchen, die zwischen drei und acht Faktoren für die Aufnahme in das modellierte multivariate Kurvenauflösung variieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, ein Tiefenprofil über der Hautoberfläche zu starten, um die Position der Hautoberfläche genau zu bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen von Hautpflegeprodukten auf wichtige Hautkomponenten, einschließlich Wasser, Proteine und Lipide.
