Im Vergleich zu anderen Methoden ist dieses Protokoll leichter, neue Antagonisten, Agonister und allosterische Modulatoren quantitativ und qualitativ zu finden, ohne die Hydroverdünnungsstruktur und die Bildung des Zielproteins zu kennen. Dieses Protokoll ist hocheffizient, einfach zu handhaben, wirtschaftlich und kommerziell erhältlich. Kombinieren Sie diese Hochdurchsatz-Screening-Methode mit der ITC-Analyse, die funktionellen kleinen Peptide können quantitativ und qualitativ erhalten werden.
Demonstriert wird das Verfahren von Ying Zhao und Qiang Wang, Absolventen unseres Labors. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Lösung von FGFR2 in Beschichtungspuffer mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter vor. Einen Milliliter der Lösung zu einer 35-Quadratzentimeter-Schale geben und immer wieder wirbeln, bis die Oberfläche vollständig nass ist.
Über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Gießen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung ab und fügen Sie die vorbereitete Blockierlösung hinzu. Bei vier Grad Celsius mindestens eine Stunde inkubieren, dann die Sperrlösung entsorgen und die Platte mit TBST sechsmal waschen und gleichzeitig sicherstellen, dass die Schale nicht austrocknet.
Rekonstituieren Sie die ursprüngliche Phagenbibliothek in einem Milliliter TBST und fügen Sie diese der beschichteten Schale hinzu. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig auf einem Shaker bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Danach den Überstand entsorgen und die Schale 10 Mal mit TBST waschen.
Elute den gebundenen Phagen, indem Sie einen Milliliter 0,2 Molglycin HCL in die Schale geben und bei Raumtemperatur 10 Minuten sanft schaukeln. Übertragen Sie das Eluent in ein sterilisiertes Mikrozentrifugenrohr und neutralisieren Sie es mit 100 Mikrolitern eines Molaren Tris-HCL bei pH 9,1. Zuerst die vorbereiteten LB- und IPTG X-Gal-Platten bei 37 Grad Celsius mindestens eine Stunde vor Gebrauch vorwärmen.
Mit Pipettenspitzen mit Filterpatronen 100 Mikroliter zehnfacher Verdünnungen des Eluenten in LB zubereiten. Nachdem die vorbereitete E.coli-Kultur die Mid-Log-Phase erreicht hat, geben Sie 200 Mikroliter der Kultur in sterilisierte Mikrozentrifugenröhren eins für jede Eluentverdünnung. Um die Infektion zu initiieren, fügen Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung in die Röhren, die die E.coli-Kultur enthalten. Wirbel schnell und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Dann verwenden Sie Beschichtungsstäbe, um die LB- und IPTG X-GAL-Platten mit 90 Mikrolitern dieser Mischung zu beschichten. Nach fünf Minuten die Platten umkehren und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Zählen Sie Plaketten, wenn sie erscheinen.
Zunächst die Nachtkultur in 20 Milliliter LB in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben verdünnen. Fügen Sie das ungezügelte Eluent hinzu und brüten Bei 37 Grad Celsius mit kräftigem Schütteln für 4-1/2 Stunden. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kultur bei 12.000 Mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr. Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen und entsorgen Sie das Pellet. Übertragen Sie die oberen 80% des Überstandes in ein frisches Rohr und fügen Sie es zu 1/6 Volumen von 20%Polyethylenglycol und 2,5 Mol Natriumchlorid.
Lassen Sie den Phagen über Nacht bei vier Grad Celsius ausfallen. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie den gefällten Phagen bei 12.000 Mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und die Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen erneut.
Verwenden Sie eine Pipette, um den Restüberstand zu entfernen. Das Pellet in einem Milliliter TBS wieder aufhängen und den Überstand in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Mikrozentrifugenrohr und fällen Sie erneut, indem Sie 1/6 Volumen von 20%Polyethylenglycol und 2,5 Mol Natriumchlorid hinzufügen. 15 bis 60 Minuten auf Eis bebrüten. Als nächstes Zentrifuge bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und die Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen erneut. Verwenden Sie eine Pipette, um den Restüberstand zu entfernen. Setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter TBS und Zentrifuge für eine zusätzliche Minute aus, um Verunreinigungen zu entfernen.
Dann den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenrohr geben, um das verstärkte Eluent zu erhalten. In dieser Studie wird die Anzahl der Phageneingaben unverändert gehalten, während die Beschichtungskonzentration von FGFR2-Protein enden wird. Die Ergebnisse des Phagen-Titers deuten darauf hin, dass die Zahl der wiedergewonnenen Phagen allmählich zunimmt und dass nach drei Runden eine 65-fache Zunahme im Vergleich zur ersten Runde zu verzeichnen ist.
Anschließend wird ein ITC-Experiment durchgeführt, um die Affinität des kleinen Peptids zu FGFR2 zu messen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das SP1-Peptid eine hohe Affinität zu FGFR2 hat. Diese Daten zeigen die Effizienz des Screening-Protokolls.
Um die biologische Aktivität des SP1-Peptids zu untersuchen, wird ein Fibroblasten-Proliferationstest mit einem CCK-8-Kit durchgeführt. BALB/C3T3 werden mit dem SP1-Peptid in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das SP1-Peptid das Wachstum der Zellen unterdrückt.
Hier muss die Kontamination durch Wildphagen vermieden werden. Achten Sie darauf, aerosolbeständige Pipettenspitzen zu verwenden. Während Wachstum durch die Erlangung der Phagenverstärkung.
Dieses Verfahren kann auch beim Screening von kleinen Peptiden verwendet werden, die an Kohlenhydrate, Kulturzellen und Gewebe binden. Diese Peptide können eine weitere Amplifikation über diagnostische und gezielte
