Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol, hidro-seyreltme yapısı ve hedef proteinoluşumunu bilmeden kantitatif ve niteliksel olarak yeni antagonisterler, agonisterler ve allosteric modülatörleri bulmak daha kolaydır. Bu protokol yüksek verimli, kullanımı kolay, ekonomik ve ticari olarak mevcuttur. ItC analizi ile bu yüksek iş elde tarama yöntemi birleştirin, fonksiyonel küçük peptidler nicel ve nitel elde edilebilir.
Prosedürü gösteren Ying Zhao ve Qiang Wang, bizim laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda kaplama tamponf2 bir çözüm hazırlamak. 35 santimetre karelik bir tabağa bir mililitre çözelti ekleyin ve yüzey tamamen ıslanana kadar tekrar tekrar girdap.
Bir gece boyunca dört derece santigrat derecede titreyerek kuluçkaya yat. Ertesi gün, kaplama çözeltisini dökün ve hazırlanan bloklama solüsyonu ekleyin. En az bir saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatın, ardından bloke solüsyonu atın ve tabağı TBST ile altı kez hızlıca yıkayın ve yemeğin kurumamasını önlayın.
Orijinal faj kitaplığını bir mililitre TBST'de yeniden oluşturun ve bunu kaplamalı tabağa ekleyin. Yavaşça iki saat boyunca oda sıcaklığında bir shaker üzerinde plaka sallayın. Bundan sonra, supernatant atın ve TBST ile çanak 10 kez yıkayın.
Çanağa bir mililitre 0.2 molar glisin HCL ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe sallayarak bağlı fajı eleyin. Elüent'i sterilleştirilmiş mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve pH 9.1'de bir molar Tris-HCL'nin 100 mikrolitresi ile nötralize edin. İlk olarak, hazırLB ve IPTG X-Gal plakaları kullanmadan önce en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.
Filtre kartuşları ile pipet uçlarını kullanarak, LB'deki eluentin 10 kat seyreltmelerini 100 mikrolitre hazırlayın. Hazırlanan E.coli kültürü orta log fazına ulaştıktan sonra, kültürün 200 mikrolitresini sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüplere her elüent seyreltme için bir tane dağıtın. Enfeksiyonu başlatmak için, E.coli kültürünü içeren tüplere her seyreltmenin 50 mikrolitresini ekleyin. Girdap hızlı ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Daha sonra bu karışımın 90 mikrolitre ile LB ve IPTG X-GAL plakaları kaplamak için kaplama çubukları kullanın. Beş dakika sonra, plakaları ters çevirin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Plakları göründüklerinde say.
Başlamak için, 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde 20 mililitre LB gecede kültürü seyreltin. 4-1/2 saat boyunca güçlü sallayarak 37 santigrat derece de amplifikatsuz elüent ve kuluçka ekleyin. Sonra, 12, 000 kez G ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat kültür santrifüj.
Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın. Santrifüj tekrar aynı koşulları kullanarak ve pelet atın. Supernatantın üst %80'ini yeni bir tüpe aktarın ve %20 polietilen glikol ve 2,5 molar sodyum klorür 1/6th hacmine ekleyin.
Fajın bir gecede dört santigrat derecede çökelmesine izin verin. Ertesi gün, 12, 000 kez G ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat çökelmiş faj santrifüj. Aynı koşulları kullanarak supernatant ve santrifüj tekrar atın.
Artık supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. TBS bir mililitre pelet resuspend ve bir mikrosantrifüj tüp için supernatant aktarın. Santrifüj 12, 000 kez G ve dört santigrat derece beş dakika.
Süpernatant'ı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve %20 polietilen glikol ve 2,5 molar sodyum klorür içeren 1/6th hacmi ni ekleyerek tekrar çökeltin. 15-60 dakika buzda kuluçkaya yat. Sonra, 12, 000 kez G ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece santrifüj.
Aynı koşulları kullanarak supernatant ve santrifüj tekrar atın. Artık supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. Kirleri gidermek için peleti 200 mikrolitre TBS ve santrifüjde bir dakika daha askıya alın.
Sonra güçlendirilmiş elüent elde etmek için taze bir mikrosantrifüj tüp supernatant aktarın. Bu çalışmada faj girdisi sayısı değişmeden tutulurken, FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonu kademeli olarak azaltıldı. Faj titresinin sonuçları, kurtarılan faj sayısının kademeli olarak arttığını ve üç tur dan sonra ilk tura göre 65 kat artış olduğunu göstermektedir.
Daha sonra küçük peptidin FGFR2'ye olan yakınlığını ölçmek için bir ITC deneyi yapılır. Sonuçlar, SP1 peptidin FGFR2'ye karşı yüksek afiniteye sahip olduğunu göstermektedir. Bu veriler, tarama protokolünün verimliliğini göstermektedir.
SP1 peptidin biyolojik aktivitesini araştırmak için CCK-8 kiti kullanılarak fibroblast proliferasyon teşpisi yapılır. BALB/C3T3 farklı konsantrasyonlarda SP1 peptid ile inkübe edilir. Sonuçlar SP1 peptid hücrelerin büyümesini bastırır öneririz.
Yabani tip fajların kirlenmesinden burada kaçınılmalıdır. Aerosole dayanıklı pipet uçları kullandığınızdan emin olun. Faj amplifikasyonu elde ederek büyüme sırasında.
Bu işlem aynı zamanda karbonhidratlar, kültür hücreleri ve dokulara bağlamak küçük peptidler taramada kullanılabilir. Bu peptidler tanı üzerinde daha fazla amplifikasyon olabilir ve hedeflenen
