Comparado com outros métodos, este protocolo é mais fácil de descobrir novos antagonistas, agonisteres e moduladores alésteres quantitativos e qualitativos sem conhecer a estrutura de diluição e formação da proteína alvo. Este protocolo é de alta eficiência, fácil de manusear, econômico e comercialmente disponível. Combine este método de triagem de alto rendimento com a análise itc, os pequenos peptídeos funcionais podem ser obtidos quantitativamente e qualitativamente.
Demonstrando o procedimento estarão Ying Zhao e Qiang Wang, estudantes de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de FGFR2 no tampão de revestimento a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Adicione um mililitro da solução a um prato de 35 centímetros quadrados e gire repetidamente até que a superfície esteja completamente molhada.
Incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. No dia seguinte, despeje a solução de revestimento e adicione a solução de bloqueio preparada. Incubar a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora, depois descartar a solução de bloqueio e lavar rapidamente a placa seis vezes com TBST, certificando-se de que o prato não secar.
Reconstitua a biblioteca phage original em um mililitro de TBST e adicione isso ao prato revestido. Balance suavemente a placa em um shaker à temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, descarte o supernaspe e lave o prato 10 vezes com TBST.
Elute o phage vinculado adicionando um mililitro de 0,2 molar glycine HCL ao prato e balançando suavemente à temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o eluente para um tubo de microcentrifuuge esterilizado e neutralize-o com 100 microliters de um Tris-HCL molar em pH 9.1. Primeiro, pré-aquecimento as placas LB e IPTG X-Gal preparadas a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do uso.
Usando pontas de pipeta com cartuchos de filtro, prepare 100 microliters de diluições dez vezes do eluente em LB. Depois que a cultura E.coli preparada chegar à fase de tronco médio, dispense 200 microliters da cultura em tubos de microcentrifuuuge esterilizados um para cada diluição eluente. Para iniciar a infecção, adicione 50 microliters de cada diluição aos tubos contendo a cultura E.coli. Vórtice rapidamente e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, use varas de revestimento para revestir as placas LB e IPTG X-GAL com 90 microliters desta mistura. Depois de cinco minutos, inverta as placas e incuba-as durante a noite a 37 graus Celsius. Conte placas quando elas aparecerem.
Para começar, diluir a cultura da noite para o dia em 20 mililitros de LB em um frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros. Adicione o eluent não amplificado e incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa por 4-1/2 horas. Em seguida, centrifugar a cultura a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Transfira o supernatante para um tubo fresco. Centrifugar novamente usando as mesmas condições e descartar a pelota. Transfira os 80% superiores do supernascer para um tubo fresco e adicione-o ao 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar.
Deixe o phage precipitar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar o phage precipitado a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições.
Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em um mililitro de TBS e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuge. Centrífuga a 12.000 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos.
Transfira o supernascer para um tubo de microcentrífuga fresco e precipitar novamente adicionando 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar. Incubar no gelo por 15 a 60 minutos. Em seguida, centrífuga a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições. Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em 200 microlitadores de TBS e centrífuga por mais um minuto para remover impurezas.
Em seguida, transfira o supernatante para um tubo de microcentrifuuge fresco para obter o eluent amplificado. Neste estudo, o número de insumos de phage é mantido inalterado, enquanto a concentração de revestimento da proteína FGFR2 é gradualmente reduzida. Os resultados do phage titer sugerem que o número de phages recuperados aumenta gradualmente e que após três rodadas, há um aumento de 65 vezes em relação ao do primeiro turno.
Um experimento itc é então conduzido para medir a afinidade do pequeno peptídeo ao FGFR2. Os resultados indicam que o peptídeo SP1 tem alta afinidade com fGFR2. Esses dados demonstram a eficiência do protocolo de triagem.
Para investigar a atividade biológica do peptídeo SP1, é realizado um ensaio de proliferação de fibroblastos utilizando-se um kit CCK-8. BALB/C3T3 são incubados com o peptídeo SP1 em diferentes concentrações. Os resultados sugerem que o peptídeo SP1 suprime o crescimento das células.
A contaminação por phages do tipo selvagem tem que ser evitada aqui. Certifique-se de usar pontas de pipeta resistentes a aerossóis. Enquanto o crescimento por meio da obtenção de amplificação phage.
Este procedimento também pode ser usado na triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células culturais e tecidos. Esses peptídeos podem ser mais amplificados sobre o diagnóstico e direcionados
