다른 방법에 비해, 이 프로토콜은 표적 단백질의 수력 희석 구조 및 형성을 모르고 새로운 길항제, 고뇌, 알로스터 및 알로스터변조기를 정량적으로 그리고 질적으로 찾아내는 것이 더 쉽습니다. 이 프로토콜은 높은 효율적이고, 다루기 쉽고, 경제적이며, 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 높은 처리량 스크리닝 방법을 ITC 분석과 결합하면 기능성 소형 펩타이드를 정량적으로 그리고 질적으로 얻을 수 있다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생인 잉자오와 치앙 왕입니다. 이 절차를 시작하려면 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 코팅 버퍼에서 FGFR2 의 용액을 준비하십시오. 35 평방 센티미터 접시에 용액 의 1 밀리리터를 추가하고 표면이 완전히 젖을 때까지 반복적으로 소용돌이.
흔들림과 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 코팅 용액을 부어 준비 된 차단 용액을 추가합니다. 적어도 한 시간 동안 섭씨 4도에서 배양 한 다음 차단 용액을 버리고 접시가 건조하지 않도록하면서 TBST로 접시를 6 번 빠르게 씻으십시오.
TBST의 1 밀리리터로 원래 파지 라이브러리를 재구성하고 코팅 된 접시에 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 셰이커에 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 후, 상체를 버리고 TBST로 접시를 10 번 씻으십시오.
식기에 0.2 어금니 글리신 HCL의 1 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 결합 된 파지를 엘테. 용액을 살균 된 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 pH 9.1에서 1 개의 어금니 Tris-HCL의 100 마이크로 리터로 중화하십시오. 먼저, 준비된 LB 및 IPTG X-Gal 플레이트를 사용 전 최소 한 시간 동안 섭씨 37도에서 미리 데우세요.
필터 카트리지가 있는 파이펫 팁을 사용하여 LB에서 용액 희석제 100마이크로리터를 준비합니다. 준비된 대장균 배양이 중간 로그 단계에 도달하면 배양 200마이크로리터를 각 용출 희석에 대해 하나씩 살균된 미세원심분리기 튜브로 분배합니다. 감염을 개시하기 위하여는, E.coli 문화를 포함하는 관에 각 희석의 50 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이를 빠르게 하고 실온에서 5분간 배양합니다.
그런 다음 코팅 스틱을 사용하여 이 혼합물의 90 마이크로리터로 LB 및 IPTG X-GAL 플레이트를 코팅합니다. 5 분 후, 접시를 반전하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양. 플라크가 나타날 때 계산합니다.
우선, 250 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 LB의 20 밀리리터에서 하룻밤 문화를 희석하십시오. 증폭되지 않은 용출물을 추가하고 섭씨 37도에서 4-1/2 시간 동안 격렬한 흔들림을 추가하십시오. 다음으로, 12, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 원심분리합니다.
상체를 신선한 튜브로 옮기. 원심분리기는 동일한 조건을 사용하여 다시 한 번 펠릿을 폐기합니다. 상류체의 80%를 신선한 튜브로 옮기고 20%의 폴리에틸렌 글리콜과 2.5 개의 어금니 나트륨염화의 1/6 부피에 추가합니다.
파지는 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 침전되도록 합니다. 다음 날, 12, 000 배 G와 15 분 동안 섭씨 4도에서 침전 된 파지를 원심 분리합니다. 동일한 조건을 사용하여 상피및 원심분리기를 다시 폐기하십시오.
파이펫을 사용하여 잔류 상수체를 제거합니다. TBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 상체를 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 4도에서 5분간.
상체를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 20% 폴리에틸렌 글리콜과 2.5 개의 대구어 나트륨을 1/6 부피를 추가하여 다시 침전시합니다. 15~60분 동안 얼음에 배양합니다. 다음으로 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 4도에서 10분 간.
동일한 조건을 사용하여 상피및 원심분리기를 다시 폐기하십시오. 파이펫을 사용하여 잔류 상수체를 제거합니다. 불순물을 제거하기 위해 추가 분 동안 TBS와 원심 분리기의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
그런 다음 상체를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 이송하여 증폭 된 용출을 얻습니다. 본 연구에서는, FGFR2 단백질의 코팅 농도가 점차 감소되는 반면, 파지 입력의 수는 변하지 않고 유지된다. 파지 티터의 결과는 복구 된 파지의 수가 점차 증가하고 3 라운드 후, 첫 번째 라운드의 그것에 비해 65 배 증가가 있음을 시사한다.
그런 다음 ITC 실험은 FGFR2에 작은 펩티드의 친화성을 측정하기 위해 실시된다. 결과는 SP1 펩티드가 FGFR2를 향한 높은 친화력을 가지고 있음을 나타낸다. 이 데이터는 스크리닝 프로토콜의 효율성을 보여줍니다.
SP1 펩티드의 생물학적 활성을 조사하기 위해, 섬유아세포 증식 분석은 CCK-8 키트를 사용하여 수행된다. BALB/C3T3은 상이한 농도에서 SP1 펩타이드와 함께 배양된다. 결과는 SP1 펩티드가 세포의 성장을 억제한다는 것을 건의합니다.
야생 식 파지의 오염은 여기에서 피해야합니다. 에어로졸 내성 파이펫 팁을 사용해야 합니다. 파지 증폭을 얻어 성장 하는 동안.
이 절차는 또한 탄수화물, 배양 세포 및 조직에 결합하는 작은 펩티드를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 그 펩티드는 진단 및 표적에 추가 증폭 될 수 있습니다
