Das Bad Aufnahmetechnik wurde zuerst von Fricke (1984) 8 und Beall et al. (1990) 9, um elektrische Felder während tail-Flips generiert messen. Die Technik wurde später modifiziert und verbessert im Labor von Dr. Donald Edwards (Georgia State University) von seinem ehemaligen Doktoranden Dr. Fadi A. Issa und seine ehemaligen Postdoktorand Dr. Jens Herberholz. Weitere Verfeinerungen vorgenommen wurden und neue Forschungsergebnisse Anwendungen im Labor von Dr. Jens Herberholz wurde an der University of Maryland getestet. Ich möchte meinem Kollegen Dr. David Yager, dass Sie mich Nutzung seiner High-Speed-Video-System und meine wissenschaftliche Mitarbeiter David Rotstein und William Liden für die Hilfe bei den Experimenten danken.

Teil 1: Recording Kammer <ol><li> Die Aufnahme Kammer ist eine rechteckige Form und ist von dünnwandigen Glas. Chamber Abmessungen 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (Länge x Breite x Höhe) für Tiere von 2,5 bis 3,5 cm Gesamtlänge (gemessen vom Rednerpult zu Telson). Siehe Abb.. 1 für ein Beispiel einer Kammer in unseren Experimenten verwendet. </li><li> Alternativ kann die Aufnahme Kammern aus anderen Materialien (z. B., ungiftig durchsichtigen Kunststoff) hergestellt werden. Chambers Größe kann je nach Versuchsanordnung und Kammern variieren sollte für jede Versuchsreihe angepasst werden. Für beste Ergebnisse sollte Kammer Größe so klein wie möglich, ohne einzuengen Tiere in ihrem natürlichen Verhalten. Als Faustregel gilt, sollte die Länge und Breite der Kammer nicht mehr als drei Mal so groß wie das Tier sein. </li></ol> Teil 2: Bad Elektroden und Massekabel <ol><li> Ein Paar der Aufnahme Elektroden und einer Masseelektrode verwendet werden. Die Elektroden sind aus isoliertem Kupferdraht (26 AWG mit 0,25 mm Isolierung) hergestellt. Ein Ende des Bades Elektroden ist mit einer extrazellulären Verstärker (AM-Systeme 1700, siehe unten) angeschlossen und von 0,5 bis 1,0 mm der Isolierung sind aus den anderen Enden entfernt. Die Erdung wird mit dem Boden des Verstärkers oder einer anderen geerdeten Geräten und 2-3 cm der Isolation verbunden ist vom anderen Ende entfernt. </li><li> Bath Elektroden und Erdungskabel sind an den Innenwänden der Aufnahme Kammer mit ungiftiger Klebstoff befestigt. Recording-Elektroden werden zentral auf beiden kurzen Seiten des Kammer-und einander gegenüber (Abb. 1) positioniert. </li><li> Masseelektrode ist an einer Längsseite der Aufnahme Kammer senkrecht zur Aufnahme Elektroden (Abb. 1) positioniert. </li><li> Kammer ist mit destilliertem Wasser gefüllt. Die besten Ergebnisse werden mit Wasser von hoher Widerstand (~ 18 MOhm) erhalten. </li></ol> Teil 3: Badelektrode Aufnahmen <ol><li> Ausgänge von der Aufnahme Elektroden werden verstärkt (1000x) durch eine extrazelluläre Verstärker (AM-Systeme; Modell 1700). Signal von der Aufnahme Elektroden wird unter Verwendung einer Kombination von niedriger Frequenz (&lt;100 Hz) und Hochfrequenz-cut-offs (&gt; 5 KHz). Signal wird dann an einen Schaltkasten und einer Datenerfassungskarte (National Instruments) angeschlossen. Digitalisierte Daten werden aufgezeichnet, gespeichert und analysiert mit Software zur Datenerfassung (Photron Motion-Tools). </li><li> Alternativ können verstärkte Signal von der Aufnahme Elektroden digitalisiert mit anderen Analog-Digital-Wandlern (zB MDS Analytical Technologies, Digidata 1440) vor digitalisierten Daten, die mit anderen im Handel erhältlichen Software zur Datenerfassung (zB MDS Analytical Technologies, Axoscope). </li></ol> Teil 4: Förderung Sonde <ol><li> Eine anregende Sonde wird von einer Glaspipette (14 cm Länge) mit einem Paar feine Drahtelektroden bestückt. Elektrodenspitzen ausgesetzt sind (0,2 mm) in ein elektronisches Signal, wenn das Tier von der Sonde berührt zu produzieren. Dies erlaubt es, den genauen Zeitpunkt der Stimulation zu messen. </li><li> Ausgänge von stimulierenden Sonde verstärkt (1000x) durch eine extrazelluläre Verstärker (AM-Systeme; Modell 1700). Das Signal wird unter Verwendung einer Kombination von niedriger Frequenz (&lt;100 Hz) und Hochfrequenz-cut-offs (&gt; 5 KHz). Das Signal wird dann an einen Switch-Box und einer Datenerfassungskarte (National Instruments) angeschlossen. Digitalisierte Daten werden aufgezeichnet, gespeichert und analysiert mit Software zur Datenerfassung (Photron Motion-Tools). </li></ol> Teil 5: Video-Aufnahmen <ol><li> Ein High-Speed-Video-Kamera (FastCAM-x 1280 PCI, Photron) steht senkrecht auf der Aufnahme Kammer positioniert, um eine Seitenansicht bieten. Grad der Helligkeit im Inneren der Aufnahme Kammer muss angepasst werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen, zB durch einen Schwanenhals Beleuchtung oder andere fokussierbar Lichtquellen liefern. </li><li> High-Speed-Videografie ist kombiniert und synchronisiert mit elektronischen Aufzeichnungen über eine Breakout-Box &amp; Datenerfassungskarte (National Instruments). Verstärkte Signal aus dem Bad Elektroden ist die Breakout-Box und Messkarte mit BNC-Kabel verbunden. Eine externe Hand-Schalter auslösen beginnt die synchronisierte Video-und Datenerfassung. </li></ol> Teil 6: Experimentelle Verfahren <ol><li> Ein einzelnes Tier wird in die Kammer eingeführt und dürfen für 5 Minuten akklimatisieren. Escape-tail-Flips sind durch einzelne Armaturen unterschiedlicher Intensität ausgelöst, um den Kopf oder den Bauch, bzw.. Die Intensität der Armaturen wird durch den Versuchsleiter kontrolliert. Jede Flucht tail-Flip ist mit High-Speed-Video mit einer Bildfrequenz von 1000 m / sec, und Datenpunkte von elektronischen Feldpotentiale aufgezeichnet werden bei 25 kHz aufgezeichnet. Beginn der Bade-und Video-Aufnahme wird durch manuelle Umschaltung auf einen Trigger-Box gestartet. Die Aufnahmezeit ist durch gewählte Bildrate (zB 1000 f / sec = 4 sec gesamte Aufnahmezeit) bestimmt. Post-und Pre-Trigger-Aufnahme Mal gewählt werden. </li><li> Nichte: Badelektrode Aufnahmen sollten einmal für jeden getesteten Spezies nachgewiesen werden durch die Kombination Badelektrode Aufnahmen mit anderen verfügbaren Aufzeichnungen Methoden. In Krebse, kann ein Paar Silber-Elektroden operativ rund um die Bauchmark implantiert werden. Hervorrufenden Reize zu entkommen tail-Flips angewendet und aufgezeichnet werden elektronische Spuren von implantierten Elektroden und Bad verglichen werden kann. </li><li> Escape-tail-Flip Verhalten und entsprechende neuronale Aktivität kann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Zusammenhängen erfasst werden, in Reaktion auf visuelle Drohungen zB während Raubtier angreift, oder während der agonistischen Begegnungen zweier Krebse. Chamber Größe, Aufnahmemodus usw. muss entsprechend angepasst werden (siehe Diskussion). </li></ol> Teil 7: Analyse der Daten <ol><li> Einzel-Video-Frames werden mit Hilfe Motion-Tool-Software (Photron). Elektronische Spuren werden zur Art der neuronalen Schaltkreis, der von jedem Reiz aktiviert wurde identifizieren. Video-Daten synchronisiert physiologischen Aufzeichnungen, um die Bewegung des Tieres und der aktivierten neuronalen Schaltkreis zu bestimmen. Jede aktivierte Schaltung erzeugt ein charakteristisches elektronische Signatur (siehe Repräsentative Ergebnisse). </li><li> Latency zwischen Sonde Kontakt und neuronale / muskuläre Reaktion sind für jedes Experiment durch Messung der Verzögerung zwischen dem Einsetzen der Sonde Signal und dem Einsetzen des Signals mit dem Bad Elektroden aufgezeichnet berechnet. </li></ol> Teil 8: Repräsentative Ergebnisse Eine Reihe von einzelnen High-Speed-Video-Frames und die entsprechenden elektrischen Feld-Aufnahmen für die Flucht tail-Flip in Reaktion auf einen taktilen Reiz geliefert auf den Kopf oder Schwanz eines juvenilen Krebsen (Abb. 2). Abb.. 2A: Starke taktilen Reiz auf den Kopf stieß auf ein tail-Flip von der medialen riesigen gesteuert. Die aufgezeichneten spike der riesigen Neuron (Sternchen) und der großen phasischen Ablenkung, die folgt ermöglicht nicht eindeutig Identifizierung der tail-Flip als vermittelt durch riesige Neuronen-Aktivität. Die Rückwärtsbewegung in der Video-Spuren gezeigt bestimmt die Identität der aktivierten neuronalen Schaltkreis (MG). Abb.. 2B: Tail-Flip, vermittelt durch die seitlichen riesigen Schaltung nach einem starken taktilen Reiz war es, den Schwanz angewendet. Nach oben und Vorwärtsbewegung im Video gesehen Spuren zusammen mit dem synchronisiert elektronische Spur zeigt die riesige Spike und das große, phasische Anfangsauslenkung bestimmt die Identität der aktivierten neuronalen Schaltkreis (LG). Abb.. 2C: Tail-Flip von Nicht-Riesen Schaltung gesteuert. Eine allmähliche taktilen Reiz war auf den Thorax des Tieres geliefert. Während die Bewegung auf Video aufgezeichnet nicht zulässt, dass eine eindeutige Identifizierung der aktivierten Schaltung fehlt der elektronischen Erfassung einer riesigen spike und besteht aus viel kleineren Ausschlägen Identifizierung der aktivierten Schaltung (Non-G). Abb.. 3: Latency Messungen für alle drei Arten von Flucht tail-Flips. Die Zeit zwischen Sonde Kontakt und physiologische Reaktion wurde für sieben Tiere gemessen. Riesen-vermittelte tail-Flips sind deutlich hervorgerufen schneller als Nicht-Riesen Schwanz-Flips. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1: Ein Beispiel für eine Aufnahme Kammer in unseren Experimenten bei Tieren von 2,5-3,5 cm in Gesamtlängen verwendet. Das Bad Elektroden sind an gegenüberliegenden Seiten der Kammer geklebt, während Sie das Erdungskabel an der langen Seite der Kammer angebracht ist und senkrecht zu den Bad-Elektroden. Abbildung 2: Single Video-Frames auf 1000 m / sec und entsprechende elektronische Aufzeichnungen für drei verschiedene Arten der Stimulation aufgezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) Eine starke taktile Reiz war, den Kopf des Tieres geliefert und löste eine riesige mediale (MG) ​​vermittelt tail-Flip. Sechs Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording Spur mit dem Bad Elektroden erhalten wird, in blauer Farbe dargestellt. Der Einschub zeigt die kleine Riesenaxon spike, dass die großen phasischen Ausschläge vorausgeht. Graue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt, entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 3, sieben Millisekunden nach dem Kontakt mit der Sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) Eine starke taktile Reiz war der Schwanz des Tieres geliefert und löste eine seitliche Riese (LG) vermittelt tail-Flip. Sechs Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording-Trace mit den erhaltenenBad Elektroden ist in rot dargestellt. Der Einschub zeigt die kleine Riesenaxon spike, dass die großen phasischen Ausschläge vorausgeht. Graue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt, entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 3, acht Millisekunden nach dem Kontakt mit der Sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) Eine schwache und schrittweise taktilen Reiz war, den Kopf des Tieres geliefert und löste eine nicht-Riese (Non-G) vermittelt tail-Flip. Acht Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording Spur mit dem Bad Elektroden erhalten wird in schwarz dargestellt. Die Spur fehlt dem Giganten spike Potenzial, die großen anfänglichen Auslenkungen und besteht aus Potentiale viel kleiner Amplitude. Hellgraue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 6, 115 Millisekunden nach dem ersten Kontakt mit der Sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Abbildung 3: Response-Latenz-Messungen für sieben verschiedene Tiere beiderlei Geschlechts und ähnlicher Größe (Mittelwert ± Längen STDV: 3,2 cm ± 0,2 cm, aus Rostrums bis Telson gemessen). MG (blauer Balken) und LG (roter Balken) tail-Flips haben deutlich kürzere Reaktionszeiten Latenzen als tail-Flips, vermittelt durch Non-G (schwarze Balken)-Schaltung. Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt. Bars mit dem gleichen Buchstaben unterschieden sich nicht signifikant voneinander (Wilcoxon Signed Rank Test für paarweisen Vergleich, p &lt;0,05).

<ol>
	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Non-invasive-Aufnahmen von einzelnen Neuronen-Aktivität oder neuronalen Schaltkreis Aktivierung sind schwer zu hemmungsloser Tiere zu erhalten. Die hier beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, Muster der neuronalen Aktivierung zugrunde liegenden natürlichen Verhalten zu identifizieren. In der Vergangenheit haben wir erfolgreich diese Technik, um Muster der Aktivität in neuronalen Schaltkreisen entkommen jugendlicher Krebse messen während der Bildung der sozialen Dominanzhierarchien...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

Die Beziehung zwischen Muster neuronaler Aktivität und entsprechende Verhaltensänderungen Ausdruck ist schwierig, in hemmungsloser Tiere zu schaffen. Traditionelle nicht-invasive Methoden erfordern zumindest teilweise zurückgehalten Versuchspersonen, und sie nur eine Identifizierung zulassen einer großen Zahl von Neuronen gleichzeitig aktiviert. Auf der anderen Seite können kleine Ensembles von Neuronen oder einzelne Neuronen nur gemessen Single-Cell-Aufnahmen aus weitgehend reduziert Zubereitungen erhalten werden. Da der Ausdruck des natürlichen Verhaltens in zurückhaltender und seziert Tiere begrenzt ist, sind die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen, die solchen Verhalten zu kontrollieren schwer zu identifizieren. Hier präsentiere ich eine nicht-invasive physiologische Technik, die die Messung neuronaler Schaltkreis Aktivierung in frei lebenden Tier erlaubt. Mit einem Paar Drahtelektroden in einem mit Wasser gefüllten Kammer, notieren Sie die Bad Elektroden neuronalen und muskulären Bereich Potenziale durch juvenile Krebse während einer natürlichen oder experimentell hervorgerufenen entkommen Antworten generiert. Der primäre Flucht Reaktionen der Krebse sind durch drei verschiedene Arten von Schwanz-Flips, die die Tiere bewegen sich weg von dem Punkt der Stimulation vermittelt. Jede Art von Schwanz-flip wird von einem eigenen neuronalen Schaltkreis gesteuert, die beiden schnellsten und stärksten entkommen Antworten erfordern die Aktivierung unterschiedlicher Sätze von großer Befehl Neuronen. In Kombination mit Verhaltensbeobachtungen ermöglichen die Badelektrode Aufnahmen eindeutige Identifizierung dieser Neurone und der damit verbundenen neuronalen Schaltkreisen. So Aktivität neuronaler Schaltkreise zugrunde liegenden natürlichen Verhalten kann in hemmungsloser Tieren und in verschiedenen Kontexten Verhaltens gemessen werden.

Watch this Scientific Journal Video about Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals at JoVE.com

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Nicht-invasive Messungen der neuronalen Aktivitätsmuster in frei lebenden Tier werden durch die Kombination neurophysiologischen Aufnahmen mit hoher Geschwindigkeit Videografie erhalten.

Recordings of Neural Circuits Aktivierung in Frei Behaving Tiere

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Aufrufe.  University of Maryland. Nicht-invasive Messungen der neuronalen Aktivitätsmuster in frei lebenden Tier werden durch die Kombination neurophysiologischen Aufnahmen mit hoher Geschwindigkeit Videografie erhalten.

Serie: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Forschung

Biologie

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Maßnahmen der Herz-und Ventilatorische Preise bei frei laufenden Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modellierung biologischer Membranen mit Leiterplatten und Messung elektrischer Signale in Axone: Schülerlabor Übungen

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.