A imagem CSOM de fotometria de fibra combina indicador personalizado geneticamente codificado e fibras ópticas para monitorar a atividade neural em animais em movimento livre. O que é fundamental para entender como um grupo específico de neurônios joga na direção ou resposta a uma ação ou um estímulo. Esta técnica é uma maneira acessível de registrar a partir de regiões cerebrais específicas que são definidas por sua conexão ou perfis genéticos, com o controle incorporado para separar o sinal ao ruído.
Demonstrando que o processador será, Ekaterina Marciaova, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório. Comece soltando todos os parafusos do tradutor de cinco eixos. Parafuso no cabo de remendo para o adaptador que é afixado ao tradutor de cinco eixos.
Em seguida, ligue a luz de excitação de 470 nanômetros em baixa potência e posicione a ponta da fibra apontando para um slide de plástico auto fluorescente. Próximo registro do semicondutor de óxido de metal gratuito ou câmera CMOS no modo ao vivo. Aumente o ganho ou ajuste a tabela de pesquisa até que a imagem esteja visível no ponto focal do objetivo.
Avance o tradutor de cinco eixos para o objetivo de garantir que a luz de 470 nanômetros esteja centrada na fibra na extremidade SMA ou FC do cabo de remendo, até que uma imagem possa ser resolvida na câmera. Por fim, ajuste os eixos X e Y até que a imagem esteja centrada e bem resolvida. Visualize a luz emitida da extremidade variole do cabo de remendo, pois deve aparecer como um círculo isotrótrópico.
Comece ligando todas as luzes de excitação para visualizar melhor as fibras. E ajustar a câmera ganha de tal forma que nenhum pixel está saturado, e uma imagem clara das fibras estão presentes. Então tire uma imagem preliminar.
Desenhe regiões de interesse ou ROIS em torno das fibras. E guardá-los para a medição dos valores médios de intensidade durante as gravações. Para gravações de fibras múltiplas, teste para independentes por gravação ao vivo de todas as fibras.
Aponte uma fibra para uma fonte de luz, e bata com um dedo. Observe flutuações no canal. Em seguida, aplique fita colorida na extremidade das fibras para rotular qual ROI corresponde a qual fibra.
Por fim, configure a área de gravação pendurando o cabo de remendo acima da arena usando suportes, grampos e suportes. Por fim, certifique-se de que o animal não será limitado em movimento pelo comprimento da fibra e pode se mover livremente por toda a arena. Comece inspecionando a extremidade distal das fibras do cabo de remendo por olho, e com um mini microscópio de fibra.
Se a superfície das fibras estiver arranhada, re polir as fibras usando filme de polimento de fibras com grão fino. Em seguida, limpe as extremidades distais do cabo de remendo com 70% de etanol e um aplicador de ponta de algodão. Limpe as cânulas de fibra óptica usando 70% de etanol e um aplicador de ponta de algodão.
Conecte a extremidade variole do cabo de remendo à fibra implantada usando uma manga dividida de cerâmica coberta com um tubo de encolhimento preto. Durante a conexão, certifique-se de que a manga está apertada. Deixe o animal se recuperar por alguns minutos.
Em seguida, comece a gravar o sinal óptico e execute o experimento. Enquanto a gravação mantém um olho cuidadoso no rastreamento ao vivo para garantir gravações de qualidade. E observe se há saltos no sinal, indicando que a manga não está apertada o suficiente.
Para as gravações de cores duplas, adicione um LED de 516 nanômetros ao sistema de fotometria para excitar o sensor de cálcio fluorescente vermelho e espelhos e filtros dirómicos apropriados. Em seguida, adicione um divisor de imagens entre o objetivo e a câmera CMOS para separar os comprimentos de onda de emissão verde e vermelho. Por fim, desenhe ROIS em torno de todas as fibras nas cores, vermelho e verde.
Certifique-se de identificar claramente cada ROI com a fibra e canal correspondentes. Acione a excitação simultânea com 470 nanômetros e 560 LEDs de nanômetros, e alterná-los com um LED de 410 nanômetros. Os resultados indicam que a fluorescência medida aumentou significativamente simultaneamente com a administração de puffs de ar para camundongos com ativação da via LHA-LHB.
No entanto, em camundongos que expressam proteína fluorescente verde ou GFP, nenhuma alteração no sinal foi detectada durante a administração de puffs de ar. Essa técnica permite que os pesquisadores regissuem razoavelmente a partir de tipos específicos de células em diferentes regiões cerebrais. Enquanto um animal se comporta livremente.
Isso aprofunda a capacidade de dissecar as funções dessas regiões cerebrais à medida que se relacionam com o comportamento.
