Unser Protokoll ermöglicht die simultane Abbildung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität in wachen Mäusen. Es kann breit angewendet werden, um das Überwachungsverhalten von Mikroglia oder die Interaktion mit Neuronen zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Bewegungsartefakte die Bilddaten aufgrund der robusten Kopffixierung nicht leicht kontaminieren.
Außerdem ermöglicht uns die Wiederherstellung nach der Bildgebung mit der hohen Bildrate, Bewegungsartefakte aus den Daten zu eliminieren. Bei dieser Methode sind die AAV-Injektion und die Operation der Schädelfensterimplantation technisch anspruchsvoll. Scheitern ist am Anfang üblich, also seien Sie bitte nicht frustriert und üben Sie mehr.
Um das Injektionsgerät vorzubereiten, legen Sie eine Glaspipette, die mit einer 26-Gauge-Hamilton-Spritze durch einen Schlauch verbunden ist, auf einen Pipettenhalter eines stereotaktischen Instruments. Kippen Sie dann den Pipettenhalter um 60 Grad nach vorne von der vertikalen Achse. Füllen Sie die Glaspipette, die Spritze und das Verbindungsröhrchen mit flüssigem Paraffin und legen Sie die Spritze auf einen Mikroinjektor.
Verabreichen Sie der anästhesierten Maus eine Analgesie und bringen Sie die zusätzlichen Ohrbügel an. Fixieren Sie dann das Tier mit der Rückenseite nach oben auf dem stereotaktischen Instrument. Nachdem Sie Haare von der Operationsstelle entfernt und den Operationsbereich desinfiziert haben, machen Sie einen zwei Zentimeter langen Schnitt auf der Kopfhaut entlang der Mittellinie, um eine gute Freilegung des Schädels über dem rechten primären visuellen Kortex zu gewährleisten.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Knochenhaut am freiliegenden Schädel zu entfernen. Bohren Sie den Schädel auf den stereotaktischen Koordinaten drei Millimeter lateral der Mittellinie und 5 Milliliter vor der Lambda-Linie, um ein kleines Loch mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Millimetern zu erzeugen. Legen Sie dann ein Stück transparente Folie von etwa zwei Zentimetern mal zwei Zentimetern auf den freiliegenden Schädel der Maus.
Einen Mikroliter AAV-Lösungströpfchen mit einem Pipettiergerät auf die Folie ausstoßen. Schieben Sie die Spritze vor. Setzen Sie eine Glaspipettenspitze in den Tropfen der AAV-Lösung auf der Folie ein und ziehen Sie vorsichtig an der Spritze, um die AAV-Lösung anzusaugen.
Als nächstes führen Sie die Glaspipette bis zu einer Tiefe von 500 Mikrometern von der Gehirnoberfläche durch das im Schädel entstandene Loch ein. Anschließend werden 0,5 Mikroliter AAV-Lösung mit dem Mikroinjektor mit einem Injektionsvolumenstrom von zwei Mikrolitern pro Stunde injiziert. Ziehen Sie die Nadel heraus und spülen Sie die Gehirnoberfläche mit Kochsalzlösung ab.
Erzeugen Sie durch Bohren eine kreisförmige Nut entlang der Markierung auf dem Schädel. Reinigen Sie den Schmutz, um die Sichtbarkeit des Schädels zu gewährleisten, und tragen Sie Kochsalzlösung auf, um eine Erwärmung während des Bohrens zu verhindern. Drücken Sie sanft mit einer Pinzette auf den zentralen Schädel.
Die Bohrtiefe ist ausreichend, wenn er sich mit geringem Widerstand vertikal bewegt. Wenn die Rille eine ausreichende Tiefe erreicht hat, führen Sie die Spitze der Pinzette in die Unterseite des zentralen Schädelfragments ein. Heben Sie es vorsichtig an und entfernen Sie es, um die Gehirnoberfläche freizulegen.
Mit einer 27-Gauge-Nadel stechen und zerreißen Sie die Dura am Rand der freiliegenden Gehirnoberfläche. Führen Sie die Spitze der Pinzette durch das Loch am Rand der Dura und ziehen Sie sie ab, um die Gehirnoberfläche freizulegen. Nachdem Sie die hämostatischen Fasern nacheinander in Kochsalzlösung dispergiert haben, platzieren Sie die hämostatischen Fasern entlang der Ränder des Lochs, in dem sich die durchtrennte Dura befindet.
Platzieren Sie das Schädelfenster auf der freiliegenden Gehirnoberfläche und kleben Sie es dann mit Sekundenkleber auf den Schädel, während Sie das Fenster vorsichtig andrücken. Tragen Sie anschließend Sofortkleber auf den gesamten freiliegenden Schädel auf. Befestigen Sie dann vorsichtig eine Kopfplatte am Schädel, um das Schädelfenster in der Mitte des quadratischen Lochs der Kopfplatte zu lokalisieren.
Sobald der Kleber ausreichend ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnzement auf den freiliegenden Schädel auf, um die Befestigung zwischen Kopf und Kopfblatt zu verstärken. Um die speziell angefertigte Beschattungsvorrichtung und einen LCD-Monitor zur visuellen Stimulation zu installieren, positionieren Sie zuerst das Objektiv so, dass es auf die Gehirnoberfläche fokussiert ist, und stellen Sie dann diese Linsenposition als ursprüngliche Z-Position ein. Halten Sie die XY-Koordinaten konstant und heben Sie die Objektivlinse an.
Entfernen Sie die Maus und das stereotaktische Instrument von der Objektivlinse. Befestigen Sie eine Beschattungsvorrichtung mit Silikon auf der Oberseite der Kopfplatte und achten Sie darauf, dass der Raum zwischen der Kopfplatte und der Beschattungsvorrichtung gut abgedichtet ist. Füllen Sie das Beschattungsgerät mit destilliertem Wasser.
Fixieren Sie dann die Maus mit dem stereotaktischen Rahmen unter der Objektivlinse. Setzen Sie die Fokusebene an der Gehirnoberfläche vorsichtig zurück und überprüfen Sie die Tiefe der Objektivlinse. Decken Sie die Objektivlinse mit schwarzer Aluminiumfolie ab, um eine Lichtverschmutzung durch den LCD-Monitor zu vermeiden.
Stellen Sie einen 10-Zoll-LCD-Monitor auf 12,5 Zentimeter vor die Augen der Maus auf, um visuelle Reize zu präsentieren. Konfigurieren Sie die Fluoreszenz-Einreichungssammelfilter für EGFP und R-CaMP und die Anregungswellenlänge auf 1.000 Nanometer. Erfassen Sie Bilder mit einer räumlichen Auflösung von 0,25 Mikrometern pro Pixel.
Finden Sie die Bildregion, in der R-CaMP-positive Neuronen und EGFP-positive Mikroglia gleichzeitig abgebildet werden können. In Schicht 2, 3. Erfassen Sie Bilder mit einer Bildrate von 30 Hertz.
Gleichzeitig mit der Bildaufnahme werden der Maus in 12 Richtungen in sechs Richtungen, von null bis 150 Grad in 30-Grad-Schritten, visuelle Reize präsentiert. Nehmen Sie nach der Bildaufnahme die Maus vom Mikroskoptisch. Trennen Sie das Shading-Gerät und das stereotaktische Instrument von der Maus und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
Unter Verwendung dieses Protokolls wurden eine AAV-Injektion und eine Implantation des Schädelfensters im primären visuellen Kortex einer acht Wochen alten transgenen Maus durchgeführt, gefolgt von einer Zwei-Photonen-Bildgebung der R-CaMP-basierten neuronalen Aktivität und Mikrogliadynamik in den Schichten 2, 3. Der Maus wurden knirschende visuelle Reize präsentiert und die visuellen Antworten in der adendritischen Wirbelsäule wurden anhand von Kalziumspuren analysiert. Die Fortsätze der Mikroglia zeigten eine schnelle Dynamik und veränderten ihre Morphologie innerhalb von 10 Sekunden.
Mittels Zwei-Photonen-Bildgebung in Schicht 2, 3 des primären visuellen Kortex in einer 12 Wochen alten transgenen Maus wurde R-CaMP in Neuronen beobachtet, hier in Magenta. Ein EGFP wurde in Mikroglia beobachtet, die in grün dargestellt sind. Einzelne Signale wurden auch für EGFP und R-CaMP beobachtet.
Eine erfolgreiche AAV-Injektion ist für diese Methode entscheidend. Die Hauptgründe für eine fehlgeschlagene AAV-Injektion sind die Uhrglaspipetten und die Gewebeschäden. Es wurde festgestellt, dass das Überwachungsverhalten auf Mikroglia und die Mikroglia-Interaktion des SNAP bei verschiedenen pathogenen Mechanismen, wie z.B. der Alzheimer-Krankheit, vorherrschend sind.
Unsere Methode ist für die Forschung auf diesem Gebiet von Vorteil.
