Dieses Protokoll hat einige der besten Erkenntnisse, die wir bisher haben, darüber, wie Candida albicans den Magen-Darm-Trakt der Säugetiere bewohnt. Zum Beispiel wussten wir bis vor kurzem nicht wirklich, wo Candida im Darm lokalisiert ist oder welche seiner vielen morphologischen Formen es in dieser Nische annimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht, Candida in seiner natürlichen Umgebung zu visualisieren, ohne die dreidimensionalen Wechselwirkungen des Pilzes mit Wirtsstrukturen oder mit Bakterien in der Mikrobiota zu stören.
Da der Darm eine komplexe Umgebung ist, ist es sehr schwierig, im Labor zu modellieren und daher war es sehr befriedigend, einen Weg zu finden, Candida Biologie direkt in einem Wirtsmodell zu erforschen. Bestimmte Komponenten der Darmmikrobiota einschließlich Candida albicans stehen im Verdacht, rollen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik kann möglicherweise verwendet werden, um das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen in Biopsieproben von Patienten zu diagnostizieren.
Die Beherrschung der Gavage-Technik und die Fähigkeit, Magen-Darm-Segmente zu sezieren, ohne die Organe zu zerreißen, ist wichtig, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zu Beginn, gavage jedes Tier mit dem berechneten Volumen eines bestimmten Inokulum. Befestigen Sie eine autoklavierte Tierfütterungsnadel an einer Ein-Milliliter-Spritze und füllen Sie die Spritze mit einem Gavage-Volumen, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt werden.
Legen Sie die Spritze auf eine sterile Oberfläche. Um das Tier zu sichern, halten Sie es an der Basis des Schwanzes mit der dominanten Hand und schieben Sie die nicht dominante Hand auf den Rücken des Tieres auf die lockere Haut direkt hinter den Ohren. Sammeln Sie den Scruff fest mit Daumen und Zeigefinger zusammen.
Nehmen Sie das Tier durch die Scruff, kippen Sie es um und schleifen Sie den kleinen Finger der gleichen Hand um den Schwanz, um das Tier gegen die Handfläche zu immobilisieren. Erweitern Sie den Kopf des Tieres sanft, so dass er in einer geraden Linie mit dem Körper ist. Nehmen Sie dann die Spritze mit der dominanten Hand auf und halten Sie sie senkrecht zum Tier mit der gekrümmten Nadel nach unten.
Verwenden Sie die Kugel der Nadel, um sanft eine innere Ecke des Mundes zu haken und die Nadel entlang der Seite des Mundes auf die Rückseite des Rachens zu schieben, dann bewegen Sie die Nadel in die Mitte. Sobald sich die Kugel der Nadel an der Rückseite des Rachens des Tieres befindet, kippen Sie die Nadel nach oben, so dass sie parallel zur Körperlinie des Tieres ist, und lassen Sie sie sanft die Kehle hinuntergleiten. Wenn die Nadel nicht glatt in den Hals gleitet, ist die Nadel möglicherweise nicht richtig positioniert und sollte zurückgezogen werden, um sich neu zu positionieren und es erneut zu versuchen.
Bringen Sie die Nadel sanft voran, so dass das Tier die Nadel schlucken kann, bis nur wenige Millimeter sichtbar bleiben. Testen Sie, ob sich die Kugel der Nadel im Magen befindet, indem Sie den Kolben sanft voranbringen, und wenn kein Widerstand vorhanden ist, setzen Sie die Abgabe des Inokulums fort. Ziehen Sie die Nadel nach der Verabreichung des Inokulums langsam ab und legen Sie das Tier in seinen Käfig.
Überwachen Sie das Tier fünf bis zehn Minuten lang auf Anzeichen von atemgedauerter Atmung oder Seenot und überprüfen Sie, ob es kurz nach dem Gavage wieder normal aktiv wird. Wenn das gleiche Inoculum für das nächste Tier verwendet wird, reinigen Sie die Nadel mit einem Alkoholtücher. Wenn ein anderes Inokulum verwendet wird, ersetzen Sie die Nadel.
Verwenden Sie stumpfe Zange, um einen Abschnitt der Bauchhaut zu kneifen und die Haut und die darunter liegende Faszie in der Nähe der Beckenbasis mit einer Schere zu prägnieren. Verlängern Sie den Schnitt in einer U-Form entlang jeder Seite der Peritonealhöhle bis zum Brustkorb, und heben Sie dann die Haut aus dem Weg. Verwenden Sie stumpfe Zangen, um das Cecum vorsichtig aus der Peritonealhöhle mit einer Schere zu extrahieren, um die Verbindungen zwischen dem Cecum und dem kleinen und großen Darm zu trennen.
Legen Sie das gesamte Cecum in eine Histologiekassette, so dass es ungedreht ist und flach liegt. Legen Sie das zweite Schaumstoffpad oben und schließen Sie die Kassette. Dann legen Sie die Kassette in ein Schraubverschlussglas mit Methacarn.
Verbrauchen Sie den Abschnitt des Dickdarms, der ein bis zwei Fäkalienpellets enthält und eine Länge hat, die kleiner ist als die der Kassette. Legen Sie das Gewebe in die Kassette, so dass es flach und ungedreht bleibt. Überlagern Sie es mit dem zweiten Schaumstoffpad, schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in das Methacarn.
Für jeden Abschnitt des Dünndarms, der beprobt werden soll, wird ein ein bis zwei Zentimeter großes Segment, das etwas Verdauungsmaterial enthält, verbrauchen. Legen Sie das Gewebe in die Kassette, überlagern Sie mit dem zweiten Schaumstoffpad, schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in das Methacarn. Beim Ausatmen des Magens, trennen Sie die Verbindungen zur Speiseröhre und dem Dünndarm.
Legen Sie das Gewebe in die Kassette und legen Sie die Kassette in das Methacarn. Lassen Sie die Kassetten in der Methacarn-Lösung bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden, aber weniger als zwei Wochen. Entfernen Sie nach der Fixierung die Schaumstoffpads und geben Sie jeden intakten Gewebeabschnitt in die Kassette zurück.
Dann waschen Sie das Gewebe zweimal für 35 Minuten in 100%Methanol, zweimal für 25 Minuten in 100%Ethanol und zweimal für 20 Minuten in Xylol. Die Kassetten trocken auf ein Papiertuch klopfen und in einem vorgeschmolzenen Paraffinwachs zwei Stunden bei 70 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen unterbringen. Dann entfernen Sie die Kassetten aus dem Wachs, lassen Sie das überschüssige Wachs abtropfen und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis sie in Wachsblöcke eingebettet sind.
De-Wachs das Paraffin eingebettet histologische Abschnitte durch Einsetzen der Dias in ein vorgewärmtes Glas mit Xylol gefüllt. Lassen Sie das Glas bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten, dann entsorgen Sie die Xylol-Wäsche. Gießen Sie frische Raumtemperatur Xylol in das Glas und wiederholen Sie die Inkubation.
Dann füllen Sie das Glas mit 100%Ethanol und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Inkubation die Dias aus dem Glas entfernen und an der Luft trocknen. Um die C.albicans mit einer Fischsonde zu färben, beginnen Sie mit einem Pat Pen einen Kreis um den Gewebeabschnitt zu ziehen.
Pipette 50 Mikroliter Sonde mit Hybridisierungslösung auf das festinstallierte Gewebe und sanft mit der Pipettenspitze verteilen. Überlagern Sie die Flüssigkeit mit einem Hybridisierungs-Abdeckungsslip, der dafür sorgt, Dassblasen zu vermeiden sind. Dann versiegeln Sie die Dias in einer wasserdichten Hybridisierungskammer und bebrüten die Abschnitte drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen im Dunkeln.
Nach der Inkubation die Waschlösung in ein Coplin-Glas geben. Entfernen Sie den Deckelrutsch vorsichtig mit Zangen von der Rutsche und legen Sie die Rutsche in die Waschlösung. Bedecken Sie das Glas mit Aluminiumfolie und bebrüten Es bei 50 Grad Celsius für 20 Minuten.
Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie die Waschlösung ausgießen und das Glas mit PBS nachfüllen. Sofort abgießen und mit frischem PBS nachfüllen, der den Prozess für insgesamt zwei Wähbe wiederholt. Wick weg die PBS mit einer empfindlichen Aufgabe wischen und kreisen Die Darmgewebe Abschnitt mit einem Pat Pen.
Legen Sie die Dias in einen undurchsichtigen Kunststoffbehälter und fügen Sie 50 Mikroliter Mucin-Kernfärbungslösung in den Gewebebereich ein. Bedecken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie und bebrüten Ihn 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation die Dias in ein Coplin-Glas geben und zweimal mit PBS waschen.
Tippen Sie auf die überschüssige PBS auf einem Papiertuch und leiten Sie dann die letzten Tropfen mit einem Gewebe ab. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf jedem Abschnitt und überlagern Sie es mit einem Glasdeckel, der dafür sorgt, dass Blasen verhindert werden. Lassen Sie das Montagemedium unter dem gesamten Deckschein verteilen.
Verankern Sie den Deckelrutsch mit Nagellack an den Ecken und stellen Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um C.albicans in vitro und in Wirtsgewebe fluoreszierend zu kennzeichnen. In-vitro-vermehrte Hyphen, runde Hefezellen, Darmzellen und undurchsichtige Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und mit Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie unterschieden.
Runde Hefen und hochlängige Hyphen wurden im Maus-Dickdarm abgebildet. Wirtsgewebe wurden mit der C.albicans-spezifischen Sonde oder der Panfungalsonde gefärbt. C.albicans wurde als rot, Wirtszellkerne blau und die Schleimschicht grün beschriftet.
C.albicans wurde in verschiedenen Segmenten des murinen GI-Trakts einschließlich der Regionen, die unmittelbar an die Wirtsschleimhaut angrenzen, und zentraleren Regionen des Darmlumens nachgewiesen. Für Wissenschaftler, die die Gavage-Technik noch nicht durchgeführt haben, ist es wichtig, eine spezielle Ausbildung zu erhalten, bevor sie diese Methode versuchen. Nach der Fischfärbung können immunfluoreszierende Techniken verwendet werden, um zusätzliche Merkmale der Wirtsschleimhaut zu färben.
Dies kann eine Charakterisierung von Gewebeschäden oder Immunreaktionen des Wirts ermöglichen. Diese Technik hat es uns ermöglicht, die Beziehung zwischen pilzzellmorphologie von Candida albicans Mutanten und Überleben innerhalb des Wirts zu charakterisieren, was unser Verständnis der Candida albicans Biologie fördert, die bei der Entwicklung von Therapien genutzt werden kann.
