Das in diesem Video gezeigte Protokoll ermöglicht es uns, die Rolle von Darmmetaboliten bei der Pilzhyphypomorphogenese zu verstehen. Diese ex vivo Technik mehr oder weniger die nächste Annäherung des Darms für die Untersuchung der Pilzhyphypomorphogenese in einer Weise, die keine In-vitro-Studie replizieren kann. Diese Methode kann angewendet werden, um die Rolle von Darmmetaboliten auf andere enterische Krankheitserreger zu untersuchen.
Sezieren Sie Mäuse mit autoklavierten sterilisierten scharfsinder Schere und Zange. Nach der Euthanasie, sichern Sie das Tier an einer Sezierfläche, indem Sie alle Gliedmaßen anheften, um den Bauch zu entblößen. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell an Zangen, Scheren oder Darmabschnitten klebt.
Verwenden Sie Zangen, um einen Teil der Haut an der Basis des Bauches zu kneifen und zu heben und einen kleinen Schnitt durch die Haut und die zugrunde liegende Faszie zu erstellen, wobei darauf geachtet wird, dass das Cecum oder die Darmwand nicht durchbrochen wird. Erweitern Sie diesen Schnitt auf den Rippenkorb, der die Peritonealhöhle teilweise freilegt, und machen Sie dann einen Schnitt, der an der Stelle des anfänglichen Schnitts auf beiden Seiten beginnt und sich nach oben und seitlich erstreckt. Ziehen Sie diese Klappen seitlich und heften Sie sie an die Sezierender Oberfläche, um die Peritonealhöhle vollständig freizulegen.
Extrahieren Sie den GI-Trakt mit Zange, während Sie eine Schere verwenden, um Schnitte zu machen, die dem Magen und der distalen Region des Dickdarms überlegen sind, um die Sammlung der größten Menge an Darmgehalt zu gewährleisten. Achten Sie beim Entfernen des GI-Trakts darauf, dass die einzelnen Komponenten nicht zerbrechen. Trennen Sie den Magen, Dünndarm, Cecum, und Dickdarm an ihren proximalen und distalen Enden.
Für die Sammlung von Darminhalten aus jedem Abschnitt, machen Sie einen einzigen Schnitt am distalen Ende, dann manuell den Darminhalt in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Zangen zu vertreiben. Bewahren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius für Ex-vivo-Assays auf. Streifen Sie eine frische Kultur von C.albicans SC5314 auf eine YPD AgarPlatte und bebrüten sie über Nacht bei 30 Grad Celsius.
Am nächsten Tag zwei oder drei mittelgroße Einzelkolonien pflücken und in einem Milliliter PBS wieder aussetzen. Holen Sie gefrorenen Darminhalt aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie bei 25 Grad Celsius auf. Etwa 150 Milligramm Darminhalt in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr geben und mit 150 Mikroliter PBS wieder aufhängen.
Wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit an, um den Darminhalt zu homogenisieren und sie etwa eine Minute bei Raumtemperatur sitzen zu lassen. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1.000 mal G für drei Minuten, dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr, wobei darauf geachtet wird, keine Trümmer zu übertragen. Nach der Wiederholung der Zentrifugation 10 Mikroliter des C.albicans inoculum inoculum zum Überstand geben, gut mischen und die Probe vier bis fünf Stunden bei 37 Grad Celsius bebrüten.
Um die Wirkung von exogenen Metaboliten auf C.albicans zu testen, fügen Sie die gewünschte Konzentration von Metaboliten in den Darmgehalt und das PBS-Gemisch ein, wirbeln Sie die Probe dann 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit aus, lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen und zentrifugieren und impfen, wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie die Pilzzellkultur bei 1.000 mal G für zwei Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fixieren Sie die Proben in 100 Mikroliter von 2%PFA für 15 Minuten, dann wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
Waschen Sie die Proben zweimal mit einem Milliliter PBS nach Manuskriptanweisungen, dann inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter PBS mit polyklonenem C.albicans Antikörper für 30 Minuten. Nach der Inkubation, waschen Sie die Probe drei weitere Male mit PBS, arbeiten in dim Licht, um Photobleicharbeiten zu vermeiden. In einem dunklen Raum die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten in 100 Mikroliter PBS mit Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Antikörper bei einer verdünnungsgemäßen ein bis 500.
Nachdem Sie die Probe dreimal mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, setzen Sie sie in 100 Mikroliter PBS wieder auf und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf eine 96-Well-Platte. Stellen Sie die Pilzzellen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsmikroskop mit 20X- und 40X-Objektivlinsen und einem grünen Fluoreszenzproteinfilter ab. Wenn C.albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, entwickelt es sich in der Regel mit einer Hefemorphologie.
Wenn C.albicans jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, erfährt es leicht einer Morphogenese, die zu Hefe- und Hyphenformen führt. Dies deutet darauf hin, dass die Behandlung von Antibiotika Veränderungen in der zekalen Umgebung verursacht, die eine Hyphalmorphogenese von C.Albicans induzieren. Die exogene Zugabe von Glukose zum Cecal-Homogenat von antibiotikabehandelten Mäusen zeigte eine massive Hyphalentwicklung ex vivo.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zugabe von Darmmetaboliten zurück zum Cecal-Homogenat der antibiotikabehandelten Mäuse die Morphogenese von C.albicans differenziell reguliert. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Optimierung der Verdünnung des Darmgehalts eine ausreichende Sammlung von Darmmetaboliten ohne Sammlung von Schmutz sicherstellt. Überschreiten Sie nicht eine Verdünnung des Medien-zu-Darm-Inhalts von zwei zu eins und zielen Sie nach Möglichkeit auf eine geringere Verdünnung ab.
Diese Technik wird jetzt verwendet, um zu erforschen, wie spezifische Metaboliten in der Darm-Wirkung Hyphal-Entwicklung, so dass Forscher besser verstehen, die Rolle der Darmmetaboliten auf Pilz pathogenese.
