Dies ist ein einfaches Protokoll für die Synthese von funktionalisierbaren, nahinfrarot emittierenden photolumineszierenden Gold-Nanoclustern und deren Detektion mit einem kommerziellen Setup. Einer der Hauptvorteile dieser Technik ist, dass die Befestigung von thiol-funktionalisiertem Liganden und die Kopplung von amin-funktionalisiertem Liganden auf der Oberfläche von Gold-Nanoclustern die photolumineszierenden Eigenschaften und die Spulenstabilität nicht beeinträchtigt. Es ist denkbar, dass die Kombination von intensiven Photolumineszenzeigenschaften und Konjugation mit Biomolekülen den In-vitro-Nachweis von anilaten Aniliden mit niedriger Konzentration, Biosensing, Solubling und Bio-Imaging ermöglichen wird.
Demonstriert wird das Verfahren von Klaudia Kvakova, meiner Doktorandin. Die Durchflusszytometrie wird von der Wissenschaftlichen Assistentin Alzbeta Magdolenova demonstriert. Der mikroskopische Teil wird von Vaclav Bocan, einem Gradstudenten des Lenka Libusova Labors, demonstriert.
Beginnen Sie mit 7,8 Milligramm Thioctsäure in 60 Mikroliter n.G. zweimolarem Natriumhydroxid zu 23,4 MilliliterRinwasser und rühren Sie das Gemisch, bis es vollständig gelöst ist. Als nächstes 10,2 Mikroliter Wasserstofftetrachloraurat in die Lösung geben und nach 15 Minuten 480 Mikroliter frisch zubereitetes Natriumborohydrid unter kräftigem Rühren hinzufügen. Die Reaktionsmischung über Nacht weiter rühren.
Am nächsten Tag die Lösung mit drei Zyklen der Ultrafiltration mit einem Molekulargewicht Abschaltung von drei Kilodalton reinigen, dann 15,6 Milligramm Thiol-terminiertes Polyethylenglykol in die Lösung geben, den pH-Wert auf zwischen 7 und 7,5 einstellen und das Gemisch über Nacht rühren, um Nanocluster 1 zu erhalten. Wiederholen Sie am nächsten Tag die drei Zyklen zentrifugieren und filtrieren, um die Dispersion zu reinigen. Mischen Sie die Nanocluster-1-Lösung mit TPP, und stellen Sie dann den pH-Wert auf 4,5 mit einem mollaren Chlorwasserstoff ein.
Starten Sie die Reaktion, indem Sie einen Überschuss von EDC HCL hinzufügen und überwachen Sie den pH-Wert der Mischung für die erste Stunde. Wenn der pH-Wert über sechs steigt, reduzieren Sie ihn durch Zugabe von Chlorwasserstoff. Rühren Sie das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur.
Führen Sie am nächsten Tag drei Zyklen der Zentrifugation und Filtration durch, wie zuvor beschrieben, um Nanocluster 2 zu erhalten. 2 mit Reinstwasser auf ein Volumen von 24 Millilitern verdünnen. Säen Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Brunnen.
Inkubieren Sie sie für 48 Stunden, dann aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 400 Mikroliter des gesamten Kulturmediums mit oder ohne 500 Mikrogramm Nanopartikel pro Brunnen hinzu. Bringen Sie die Zellen zur Verinnerung des Nanoclusters in den 37-Grad-Grad-Grad-Inkubator zurück. Lösen Sie die Zellen nach zwei Stunden mit einer Standard-Trypsinisierung.
Sammeln Sie sie in Polypropylen-Mikrozentrifugenrohren und Zentrifuge für fünf Minuten bei 350 mal g und vier Grad Celsius. Bereiten Sie den FCM-Puffer nach Manuskriptanweisungen vor und verwenden Sie einen Milliliter des Puffers, um die Zellpellets zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen für weitere fünf Minuten, setzen Sie sie dann in 500 Mikroliter des FCM-Puffers wieder ab und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Stellen Sie vor der Entnahme der Probe sicher, dass das Gerät über die entsprechende optische Konfiguration verfügt. Stellen Sie den Bandpassfilter 780 über 60 vor den 405A-Detektor. Filtern Sie alle Proben mit einem fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenrohr mit einer Zellsiebkappe.
Geben Sie die Zytometerkonfiguration an. Zeichnen Sie ein Zwei-Parameter-Punktdiagramm des FSC-A und SSC-A, um die Verteilung der Zellen anzuzeigen. Um Doublets auszuschließen, erstellen Sie ein Zweiparameter-Punktdiagramm von FSC-H im Vergleich zu FSC-A und zeichnen Sie ein Histogramm mit einem Parameter für den fluoreszierenden Kanalbereich, um die relative Fluoreszenzintensität in der Probe zu überwachen.
Erfassen Sie unbehandelte Proben mit einer niedrigen Durchflussrate, um lagegleiche Ereignisse zu minimieren. Passen Sie während der Erfassung die PMT-Spannungen an, um die unbehandelte Population auf dem FSC-gegen-SSC-Plot maßstabsgetreu zu erhalten. Passen Sie bei Bedarf die PMT-Spannungen für den FL-Kanal an, um die ungefärbte Population in der linken Ecke des Histogramms zu platzieren.
Wählen Sie dann die spezifische Gate-Registerkarte in der Software aus und zeichnen Sie ein entsprechendes Tor um die gewünschte Bevölkerung. Die Zellen innerhalb des Gates werden zum nächsten Checkpoint verschoben. Richten Sie das Experiment ein, und zeichnen Sie die Daten auf.
Nach 24 Stunden nach der Aussaat 100 Mikrogramm 2 in jede Schalenkammer geben, die 0,5 Milliliter Medium mit HeLa-Zellen enthält. Geben Sie die Schale in den Inkubator zurück und lassen Sie die Zellen die Nanocluster verinnerlichen, dann entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten, frischen Medium. Füllen Sie jede Kammer mit 800 Mikroliter frischem Medium und gehen Sie mit der Bildgebung fort.
Um die Zellen abzubilden, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit Plan-APOCHROMAT und einer 63-fachen Ölobjektivlinse. Montieren Sie die Schale auf der invertierten Bühne mit der Kammer erwärmt bis zu 37 Grad Celsius und mit einer befeuchteten, 5% Kohlendioxid-Atmosphäre versorgt. Erkennen Sie internalisierte Gold-Nanocluster mit einem 405-Nanometer-Laser, der mit einem geeigneten Strahlteiler auf 2 % Leistung eingestellt ist, wodurch der Erfassungsbereich zwischen 650 und 760 Nanometern eingestellt wird.
Legen Sie die Auflösung des Bildes um 2048 x 2048 Pixel auf. In der Einstellung für die Erfassungsgeschwindigkeit soll eine Pixelverweilzeit um vier Mikrosekunden angegeben werden, und erfassen Sie das Bild mit der zweifachen Mittelung, stellen Sie dann das Loch auf eine Flächeneinheit ein und verwenden Sie für eine höhere Empfindlichkeit den Photonenzählmodus. Für korrekte Beleuchtung und Durchlicht mit DIC verwenden Sie Kohlers Einstellung des Kondensators und Feldanschlags.
Um Durchlicht zu erfassen, verwenden Sie einen 488-Nanometer-Laser mit einer Leistung von 0,7 %, ohne dass ein Fluoreszenzdetektor zugewiesen wird, um sicherzustellen, dass ein geeigneter Strahlteiler für die Laserwellenlänge eingestellt wird. Absorptionsspektren zeigten, dass Gold-Nanocluster 1 und 2 kein charakteristisches Oberflächen-Plasmon-Band aufweisen und eine breite Emission von 550 bis 850 Nanometern aufweisen. Die Photolumineszenz erhöhte sich nach Befestigung von TPP an der Oberfläche von 1 stark.
Die Emission der Nanocluster war auch unter einem 365-Nanometer-UV-Licht sichtbar. Die Emission war stabil und ihre Wellenlänge war unabhängig von der Anregungswellenlänge, aber die Intensität war maximal, wenn sie mit UV-Licht angeregt wurde. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Aufnahme von Nanocluster 2 durch HeLa-Zellen zu bestätigen.
Die Nahe Fluoreszenz war sowohl von der Inkubationszeit als auch von der Konzentration des Nanoclusters 2 abhängig. Die Gold-Nanocluster in Zellen wurden nicht invasiv mit einem Standard-Konfokallaser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Die Zellen wurden mit Nanocluster 2 befleckt und nach 24 Stunden Inkubation wurde in den Zellen eine leuchtend rote Photolumineszenz beobachtet.
Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, dass die Entfernung von unreagiertem und hydrolysiertem Natriumborohydrid sehr wichtig ist, da sonst thioliertes Polyethylenglykol nicht an die Oberfläche von Gold-Nanoclustern bindet. Zusätzlich beginnt die Photolumineszenz von Gold-Nanoclustern ab 560 Nanometern. Um die Autofluoreszenz des Hintergrunds in konfokalen Mikroskopieexperimenten zu vermeiden, sollten die Photonen über 650 Nanometer gesammelt werden.
