Die Autoren möchten NanoVentures Australien Reise finanzielle Unterstützung und Prof. John Haycock, dass sie diese Forschung an der University of Sheffield und Frau Jaimee Mayne teilweise gehostet für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten zu bestätigen.

1. Au NRs Vorbereitung Anmerkung: Au NRs kann durch eine Reihe von Rezepturen 16 synthetisiert oder von kommerziellen Anbietern erhältlich. <ol><li> Die anfängliche optische Dichte (OD) der Au NR Lösung mittels UV-Vis-Spektroskopie, durch Aufnahme der Absorptionswerte von 300 nm bis 1.000 nm mit einer Auflösung von 0,5-2 nm. Vary das Volumen der Lösung, um mit den verfügbaren Küvetten verwendet werden. </li><li> Bewerten Sie die erste NP molare Konzentration mit einer geeigneten Technik 17 (zB UV-Vis-Spektroskopie, Einzelpartikel induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie, Transmissionselektronenmikroskopie) oder verwenden Sie die Konzentrationswerte von dem Verkäufer zur Verfügung gestellt. </li><li> Bereiten Sie eine 5 ml-Stammlösung durch die anfängliche Au NR Probe Verdünnung auf eine OD erreicht = 1. Für die beste Wiederholgenauigkeit, halten Sie die OD Konstante für alle getesteten Proben. Folgen Sie der kommerziellen Anbieters Protokoll für die Zusammensetzung des Verdünnungslösungsmittel. Falls Sie nicht sicherVerwenden Sie deionisiertes Wasser. </li><li> Zentrifuge 1 ml der Au NR Lösung zweimal für 15 Minuten bei 7800 · g, jede chemische Überschuss aus der Lösung zu entfernen. Zentrifugation-Zyklen in Kraft und Zeit (zB 20 Minuten bei 5600 × g) 18 variieren. </li><li> Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren die NRs in VE-Wasser. Als Wieder Schwebeteilchen können Aggregate in Lösung, bereiten sie täglich, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Alternativ lagern in einem Kühlschrank nicht länger als 1 Woche. Nicht einfrieren. </li><li> Bevor Sie unter Zellkulturbedingungen, beschallen die Au NR-Lösung für 5 Minuten und dann mit UV-Licht sterilisiert werden für 30 Minuten (UV-Strahlung Intensität nicht weniger als 400 mW ∙ m -2 bei 254 nm). </li></ol> 2. NG108-15 Neuronal-Zelllinie, Kultur und Differenzierung <ol><li> Aus dem Zellkulturmedium, bereiten 500 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% (w / v) fötalem Kälberserum (FCS), 1% (w / v) L-Glutamin, 1%(W / v) Penicillin / Streptomycin und 0,5% (w / v) Amphotericin B. Hinweis: Ergänzungen können aliquotiert bei -20 ° C gelagert und in den Medien am Tag erforderlich. Zellkulturmedium kann in einem sterilen Zustand für höchstens 1 Monat im Kühlschrank gelagert werden. </li><li> Für die Zelldifferenzierungsmedium, bereiten 50 ml steriles DMEM, enthaltend 1% (w / v) L-Glutamin, 1% (w / v) Penicillin / Streptomycin und 0,5% (w / v) Amphotericin B. </li><li> Wachsen NG108-15 neuronalen Zellen in 10 ml Zellkulturmedium in T75-Flaschen von Polystyrol in einem Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre (5% CO 2 bei 37 ° C). Normalerweise Saatgut 1,5-2 x 10 5 Zellen in jedem Kolben bereit zu sein, in 3-4 Werktagen. Ändern Zellkulturmedium alle zwei Tage. Hinweis: Um die genetische Drift oder Abweichung zu vermeiden, verwenden Sie keine Zellen, die älter als Durchgang 21 für Experimente. </li><li> Bei 70-80% konfluent in Kultur, ändern Sie die Medium mit warmen frisches Zellkulturmedium. Mechanisch lösen die Zellen durch vorsichtiges KnocKönig der Boden der konfluenten Flasche. Verwenden Sie keine Trypsin. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 600 × g und resuspendieren das Zellpellet in 2 ml warmem Zelldifferenzierungsmedium. </li><li> Seed 2 × 10 4 Zellen / cm 2 in einem Gewebekulturpolystyrol Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 ul Zelldifferenzierungsmedium. Inkubation des Experiments 1 Tag bei 5% CO 2/37 ° C. </li><li> Fügen Sie zwischen 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 Teilchen / ml Au NR Lösung am Tag 2 und inkubieren sie für weitere 24 Stunden. Die Partikel für den Kontrollexperimenten nicht hinzufügen. Hinweis: Als Alternative Steuerung kann mit Gold-Nanopartikeln mit einem gut differenzierten Spitzenabsorptionswellenlänge zu Vergleichszwecken 14 verwendet werden. Für eine einheitliche Zellverhalten, halten Sie die Zelldichte konstant und nicht die gut Oberfläche vor der Zellaussaat ändern. </li></ol> 3. Neuritenwachstum Enhancement <ol><li> Paarder Laser mit einem optischen Monomode-Faser (numerische Apertur = 0,13) und enden mit einem Faserverbinder (FC-Anschlüsse sind praktisch und allgemein verfügbar ist). Messen Sie die Ausgangslaserleistung mit einem Standard-Leistungsmesser. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, passen Sie die Peak-Wellenlänge des Lasers auf die Plasmonresonanzspitze der NRs. </li><li> Am Tag 3 nach NR Inkubation, fixieren Sie die FC-Stecker an den Brunnen. Bestrahlen Proben und Kontrollen bei RT für 1 min im Dauerstrich, für unterschiedliche Laserleistungen. Ermöglichen die Kultur für 3 weitere Tage bei 5% CO 2/37 ° C ablaufen. Wiederholen der Laserbestrahlung für ein Minimum von 3 unabhängigen Messungen. Anmerkung: Verschiedene Bestrahlungszeiten und Impulsfrequenzen können ausgewählt werden, abhängig von der Anwendung. </li><li> Charakterisieren Sie den Laser in Bezug auf die Strahldurchmesser und Laserbestrahlungsstärke (W ∙ cm -2). <ol><li> Bei einer Standard-Singlemode-Faser, verwenden NA = n ∙ sin θ,wobei n der Brechungsindex des Mediums, in Gebrauch und θ ist der Halbwinkel des Konus von Licht aus der Faser austretenden (siehe 1A). Von Trigonometrie r = tan θ ∙ d, wobei r der Radius des Laserstrahls ist und d der Abstand zwischen der Faser und der Probe. Die FC-Stecker auf den Durchmesser des Bohrlochs daher Beleuchten der Probe in einem Abstand d = 2,70 ± 0,20 mm. Licht tritt aus der Faser in Wasser (n = 1,33), so dass r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d. </li><li> Verwendung der letzteren Gleichung errechnen Laserstrahlradius, die entsprechende Strahlfläche und die mittlere Laserbestrahlungsstärke (Laserleistung geteilt durch Strahlfläche) am Ziel (siehe Beispiel Diagramm in 1B). Diese Werte stellen den Durchschnitt Bestrahlungsstärke auf der beleuchteten Fläche. </li><li> Bewerten der Fehler bei den Messungen mit der allgemeinen Theorie der Fehlerausbreitung. Hinweis: Der Abstand bwischen der FC-Stecker und die Probe kann durch Fotografien der Versuchsanordnung und Nachverarbeitung des Bildes mit einer geeigneten Software (zB ImageJ) gemessen werden. </li></ol></li><li> An Tag 5, entfernen Zelldifferenzierungsmedium aus den Versuchen und fixieren die Proben mit 3,7% (v / v) Formaldehyd-Lösung für 10 min, dann permeabilisiert die Zellen mit 0,1% (v / v) Triton X-100 für 20 min. </li><li> Hinzufügen von 3% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) zu den Proben für 60 min, um das nichtumgesetzte Proteinbindungsstellen zu blockieren. Beschriften der Proben für Anti βIII -Tubulin über Nacht (5 ug / ml in PBS, ergänzt mit 1% BSA) bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen für 90 min im Dunkeln inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper (zB TRITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper) mit einer Konzentration von 0,4-2 ug / ml in 1% BSA in PBS. Kennzeichnen die Zellkerne mit DAPI (0,1 &amp; mgr; g / ml in deionisiertem Wasser) für 10 min. Hinweis: Antikörper-Konjugation und Konzentration might variieren je nach Firmenprotokoll. Wash Proben zweimal mit PBS für 5 Minuten nach jeder Färbung Bühne. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li> Bildproben durch Epifluoreszenz oder konfokaler Mikroskopie unter Verwendung von mindestens einem 20 × -Objektiv. Wähle das Mikroskop filtert entsprechend an den sekundären Antikörper. Wählen Sie eine DAPI-Filter (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm), um die Zellkerne zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Bilder von der Bewertung: i) die maximale Neuritenlänge (Rekord die Länge von der Spitze des Neuriten an den Anfang des Zellkörpers), ii) die Anzahl der Neuriten pro neuronalen Zell (Fassend alle Neuriten pro Zelle) und iii) der Anteil der Zellen mit Neuriten (teilen die Gesamtzahl der Zellen βIII-Tubulin exprimieren durch die Gesamtzahl von Zellen mit einem positiv gefärbten Kern) 19. </li></ol> 4. Laser-induzierter intrazellulärer Ca 2+ Imaging <ol&gt; <li> Vorbereiten einer 20% (w / v) Stammlösung von Pluronic F-127 durch Lösen von 2 g des gelösten Stoffes in 10 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO). Erhitzt man die Lösung von Pluronic F-127 bei 40 ° C für ungefähr 20 min, um die Löslichkeit zu erhöhen. Bereiten Sie im Voraus, wenn bei RT gelagert. </li><li> Am Tag 3 nach NR Inkubation, bereiten eine ausgeglichene Salzlösung (BSS, 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, 5,6 mM Glucose und 10 mM HEPES, pH 7,4) und ergänzt es mit 5 uM Fluo-4.00 in DMSO und 0,1% (w / v) Pluronic F-127-Lösung. Anmerkung: BSS Lösung kann vorher hergestellt und für höchstens 1 Monat im Kühlschrank gelagert werden. Hinzufügen der Ergänzungs (Fluo-4 Uhr und Pluronic F-127), am Tag des Experiments. </li><li> Entfernen Zelldifferenzierungsmedium und ersetzen Sie es mit dem BSS-Lösung ergänzt. Um die besten Ergebnisse mit einem invertierten konfokalen Mikroskop zu erhalten, Inkubation der Zellen in einem Mikroobjektträgers. </li><li> Last NG108-15-Zellen mit Fluo-04.00für 30 min im Dunkeln bei 5% CO 2/37 ° C. Nach der Inkubationszeit waschen Proben zweimal mit BSS jede extrazellulärem unbelastetem Fluorophor zu entfernen. </li><li> Koppeln der Laser mit einer Einmoden-Lichtleitfaser und spalten die Spitze unter Verwendung von Standardtechniken. Beachten Sie die resultierende Spitze unter einem optischen Mikroskop, um eine hochwertige Oberfläche gewährleisten (dh die Spitze sollte senkrecht zur Faserachse und flach auf Mikroskopie Inspektion). <ol><li> Messen Sie die Ausgangslaserleistung mit einem Standard-Leistungsmesser. Legen Sie die Lichtabgabe Faser in eine optische Faser Halter und befestigen Sie es an einen Mikropositionierer. Siehe Brown et al. 20 für weitere Informationen über Glasfaser Vorbereitung und Positionierung. Achtung: Beachten Sie die allgemeinen Regeln für die Lasersicherheit während der Messung der Laserleistung (zB schauen Sie nicht direkt in den Laserstrahl, Laserschutzbrillen tragen bei der Handhabung, verhindert Streulicht Exposition gegenüber anderen Labor-Benutzer) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li> Schließen Sie ein Oszilloskop an den tragbaren Laser, um die optische Modulation zu überwachen. Verwenden Sie ein binäres Signal mit variabler Frequenz (0,5-2 Hz) und Pulslängen (20-100 ms). Verbinden des Lasers unter Verwendung des Modulationssignals als Transistor-Transistor-Logik (TTL) Eingang für das Mikroskop, im Anschluss an die in Paviolo et al. 13 gezeigten Aufbau. <ol><li> Zeigen die Zellen unter einem umgekehrten Konfokalmikroskop und Positionieren des Lichtzuführungsfaser 250 ± 50 &amp; mgr; m entfernt von der Zielzelle im Transmissionsbeleuchtungsmodus. In dieser Entfernung mit Hilfe der Gleichungen präsentiert in 3.3.1, um die Strahlradius auf das Ziel zu berechnen. </li></ol></li><li> Verwenden eines Argon-Ionenlaser (488 nm), um den internalisierten Fluo-4.00 Farbstoff anzuregen (λ ex = 494 nm; λ EM = 516 nm) und der Synchron LD für die Anregung der Endozytose NRs. Führen die Abbildung bei RT von Proben und Kontrollen unter Verwendung von mindestens einem 40 × -Objektiv durch Sammeln von Zeitreihen Scansmit 256 x 256 Pixel / Rahmen Auflösung in Roundtrip-Modus mit einer Frequenz von mindestens 4 Hz. Führen einer Aufzeichnung ohne LD Anregungs jede Argon-Ionen-Laser-Interferenz (Grundrauschen) zu identifizieren. </li><li> Entfernen Sie den Hintergrund aus den Daten mit Hilfe adaptiv gewichtet bestraft Least-Squares-Algorithmus 21. Zeichnen Sie die induzierte Ca 2+ Änderungen als eine Funktion der Zeit. Analysieren Sie die Signalspitzen in der Fluoreszenzintensität mit Bildnachbearbeitungssoftware durch Schwellen auf einem Niveau, das Dreifache der Standardabweichung der Grundrauschen (3σ). </li></ol>

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P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Die in dieser Präsentation beschriebenen Protokolle beschreiben, wie Kultur, zu differenzieren und optisch zu stimulieren Nervenzellen mit extrinsischen Absorber. Die NR Eigenschaften (zB Abmessungen, die Form, Plasmonresonanzwellenlänge und die Oberflächenchemie) und die Laserstimulationsparameter (wie zum Beispiel Wellenlänge, Impulsdauer, Wiederholungsrate usw.) können variiert werden, um verschiedene experimentelle Bedürfnisse angepasst werden. Die Auswirkungen auf das Zellverhalten können m...

Jüngste Studien haben gezeigt, daß die Übergangserwärmung mit der Absorption von Infrarotlicht durch Wasser (Wellenlänge&gt; 1.400 nm) verbunden sind, können verwendet werden, um Aktionspotentiale in Nervengewebe 1 und intrazellulären Calciumtransienten in Kardiomyozyten 2 induzieren. Die Verwendung von Infrarotlicht hat großes Interesse für Anwendungen in der Neuroprothesen angehoben, aufgrund der potentiellen feinere räumliche Auflösung, Fehlen eines direkten Kontaktes mit dem Gewebe, Minimierung der Stimulationsartefakte und das Entfernen der Notwendigkeit, genetisch die Zellen vor der Stimulation verändern ( wie in Optogenetik erforderlich) 1. Trotz all dieser Vorteile, schlug kürzlich entwickelte thermische Modelle, dass die Zielgewebe / Zellen können durch kumulative Wärmeeffekte, wenn mehrere Konjunktur Websites und / oder hohen Repetitionsraten verwendet 3,4 berührt. Als Antwort auf diese Herausforderungen haben die Forscher das Potenzial, extrinsische absor zugelassenesglieder zur Nervenstimulation, mehr lokalisierte Erwärmungseffekte im Gewebe zu produzieren. Huang et al. Gezeigt, dieses Prinzip durch Verwendung superpara Ferritnanopartikel die temperaturempfindliche TRPV1 Kanäle in HEK 293 Zellen, die mit einem Hochfrequenz-Magnetfeld 5 Ferne zu aktivieren. Obwohl diese Technik für ein tieferes Eindringen zu ermöglichen (Magnetfelder in Wechselwirkung relativ schwach mit Gewebe) wurden die Reaktionen nur über einen Zeitraum von Sekunden aufgezeichnet, anstatt Millisekundendauer in bionische Vorrichtungen 5 erforderlich. Ähnlich Farah et al. Zeigten elektrische Stimulation kortikale Neuronen der Ratte mit schwarzen Mikropartikel in vitro. Sie zeigten zellgenau in Stimulation mit Pulsdauern in der Größenordnung von Hunderten von &amp; mgr; s und Energien im Bereich von &amp; mgr; J, potenziell ermöglicht eine schnellere Wiederholraten 6. Die Verwendung von extrinsischen Absorber wurde auch angewendet, um zu induzierenmorphologische Veränderungen in vitro. Ciofani et al. Zeigten eine Zunahme ~ 40% in neuronalen Zell Auswuchs mit piezoelektrischen Bornitrid-Nanoröhren durch Ultraschall 7 erregt. Ähnlich endozytosiert Eisenoxidnanopartikel in PC12-Zellen wurde berichtet, Neuriten Differenzierung in einer dosisabhängigen Art und Weise zu erweitern, die durch die Aktivierung von Zelladhäsionsmolekülen mit dem Eisenoxid 8. Vor kurzem hat das Interesse an der äußeren Absorber auf neuronale Stimulation unterstützen auch die Verwendung von Gold-Nanopartikeln (Au-NPs) konzentriert. Gold-Nanopartikel haben die Fähigkeit, Laserlicht effizient absorbieren an der Plasmonen Spitze und sie in die Umgebung in Form von Wärme 9 zerstreuen. Unter allen verfügbaren Partikelformen, die optische Absorption des Gold-Nanostäbchen (Au NRs) bequem passt das therapeutische Fenster von biologischen Geweben (Nahinfrarot - NIR- Wellenlänge zwischen 750-1,400 nm) 10. Darüber hinaus wird in der Fortsetzungext neuronaler Stimulation, die Verwendung von Au NRs bietet relativ günstige Biokompatibilität und eine breite Palette von Oberflächenfunktionalisierung Optionen 11. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine stimulierende Wirkung auf die Differenzierung nach der kontinuierlichen Laserbelichtungen Au NRs in NG108-15 neuronalen Zellen 12 induziert werden. In ähnlicher Weise wurden die intrazelluläre Calcium Transienten in neuronalen Zellen mit Au NRs nach der Laserbestrahlung mit variablen Frequenzen und impulsmoduliert Weiten 13 kultiviert aufgezeichnet. Zellmembran Depolarisation wurde auch nach NIR Laserbeleuchtung Au NRs in primären Kulturen von Spiralganglienneuronen 14 aufgezeichnet. Die erste in vivo-Anwendung mit bestrahlten Au NRs wurde erst kürzlich unter Beweis gestellt. EOM und Mitarbeiter ausgesetzt Au NRs an deren Plasmonenspitze und erfasst eine sechsfache Erhöhung in der Amplitude der Verbindung Nervenaktionspotentiale (Cnaps) und eine dreifache Verringerung der Reizschwelle in Rattenischiasnerven. Die enhanced Reaktion wurde die lokale Erwärmungseffekte von der Erregung des NR plasmonic Peak 15 resultierende zurückzuführen. In der vorliegenden Arbeit werden die Protokolle für die Untersuchung der Auswirkungen von Laserstimulation in NG108-15 neuronalen Zellen mit Au NRs kultiviert angegeben. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, Zellpopulationen in vitro Bestrahlung mit Standard-biologischen Techniken und Materialien. Das Protokoll basiert auf einem fasergekoppelten Laserdiode (LD), der einen sicheren Betrieb und reproduzierbare Ausrichtung ermöglicht. Die Au-NR Probenvorbereitung und Laserbestrahlungsverfahren kann weiter auf verschiedene Partikelformen und neuronalen Zellkulturen ausgedehnt werden, vorausgesetzt, dass die gezielte Synthese und Kultur Protokolle bekannt sind.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Varian Medical Systems Inc.</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Mini Spin</td><td></td></tr><tr><td>Sonic bath</td><td>Unisonics Australia</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Optotech</td><td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td><td></td></tr><tr><td>Optical fiber</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>Power meter</td><td>Coherent</td><td>Laser Check</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Axon Instruments</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td><td>LSM 510 meta-confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Durch die Verwendung von hier beschriebenen Protokolle 1, 2 und 3 wurde eine stimulierende Wirkung auf die Differenzierung neuronaler NG108-15 Zellen mit Gold-Nanopartikeln kultiviert beobachtet (Au NRs, Poly (styrolsulfonat) beschichteten Au NRs und Siliciumdioxid-beschichteten Gold-NRs) nach der Laser Expositionen zwischen 1,25 und 7,5 W · cm -2. Konfokale Bilder von rhodamineB markierten Au NRs gezeigt, dass die Teilchen wurden von Tag 1 der Inkubation 12 internalisiert. Die Lokalisierung wurde...

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Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Aufrufe.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Serie: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

Gold Nanopartikel Modifizierte Kohlenstofffaser-Mikroelektroden für verbesserte neurochemische Detektion

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Chemie

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Biotechnik

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

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