Die Autoren möchten NanoVentures Australien Reise finanzielle Unterstützung und Prof. John Haycock, dass sie diese Forschung an der University of Sheffield und Frau Jaimee Mayne teilweise gehostet für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten zu bestätigen.

1. Au NRs Vorbereitung Anmerkung: Au NRs kann durch eine Reihe von Rezepturen 16 synthetisiert oder von kommerziellen Anbietern erhältlich. <ol><li> Die anfängliche optische Dichte (OD) der Au NR Lösung mittels UV-Vis-Spektroskopie, durch Aufnahme der Absorptionswerte von 300 nm bis 1.000 nm mit einer Auflösung von 0,5-2 nm. Vary das Volumen der Lösung, um mit den verfügbaren Küvetten verwendet werden. </li><li> Bewerten Sie die erste NP molare Konzentration mit einer geeigneten Technik 17 (zB UV-Vis-Spektroskopie, Einzelpartikel induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie, Transmissionselektronenmikroskopie) oder verwenden Sie die Konzentrationswerte von dem Verkäufer zur Verfügung gestellt. </li><li> Bereiten Sie eine 5 ml-Stammlösung durch die anfängliche Au NR Probe Verdünnung auf eine OD erreicht = 1. Für die beste Wiederholgenauigkeit, halten Sie die OD Konstante für alle getesteten Proben. Folgen Sie der kommerziellen Anbieters Protokoll für die Zusammensetzung des Verdünnungslösungsmittel. Falls Sie nicht sicherVerwenden Sie deionisiertes Wasser. </li><li> Zentrifuge 1 ml der Au NR Lösung zweimal für 15 Minuten bei 7800 · g, jede chemische Überschuss aus der Lösung zu entfernen. Zentrifugation-Zyklen in Kraft und Zeit (zB 20 Minuten bei 5600 × g) 18 variieren. </li><li> Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren die NRs in VE-Wasser. Als Wieder Schwebeteilchen können Aggregate in Lösung, bereiten sie täglich, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Alternativ lagern in einem Kühlschrank nicht länger als 1 Woche. Nicht einfrieren. </li><li> Bevor Sie unter Zellkulturbedingungen, beschallen die Au NR-Lösung für 5 Minuten und dann mit UV-Licht sterilisiert werden für 30 Minuten (UV-Strahlung Intensität nicht weniger als 400 mW ∙ m -2 bei 254 nm). </li></ol> 2. NG108-15 Neuronal-Zelllinie, Kultur und Differenzierung <ol><li> Aus dem Zellkulturmedium, bereiten 500 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% (w / v) fötalem Kälberserum (FCS), 1% (w / v) L-Glutamin, 1%(W / v) Penicillin / Streptomycin und 0,5% (w / v) Amphotericin B. Hinweis: Ergänzungen können aliquotiert bei -20 ° C gelagert und in den Medien am Tag erforderlich. Zellkulturmedium kann in einem sterilen Zustand für höchstens 1 Monat im Kühlschrank gelagert werden. </li><li> Für die Zelldifferenzierungsmedium, bereiten 50 ml steriles DMEM, enthaltend 1% (w / v) L-Glutamin, 1% (w / v) Penicillin / Streptomycin und 0,5% (w / v) Amphotericin B. </li><li> Wachsen NG108-15 neuronalen Zellen in 10 ml Zellkulturmedium in T75-Flaschen von Polystyrol in einem Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre (5% CO 2 bei 37 ° C). Normalerweise Saatgut 1,5-2 x 10 5 Zellen in jedem Kolben bereit zu sein, in 3-4 Werktagen. Ändern Zellkulturmedium alle zwei Tage. Hinweis: Um die genetische Drift oder Abweichung zu vermeiden, verwenden Sie keine Zellen, die älter als Durchgang 21 für Experimente. </li><li> Bei 70-80% konfluent in Kultur, ändern Sie die Medium mit warmen frisches Zellkulturmedium. Mechanisch lösen die Zellen durch vorsichtiges KnocKönig der Boden der konfluenten Flasche. Verwenden Sie keine Trypsin. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 600 × g und resuspendieren das Zellpellet in 2 ml warmem Zelldifferenzierungsmedium. </li><li> Seed 2 × 10 4 Zellen / cm 2 in einem Gewebekulturpolystyrol Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 ul Zelldifferenzierungsmedium. Inkubation des Experiments 1 Tag bei 5% CO 2/37 ° C. </li><li> Fügen Sie zwischen 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 Teilchen / ml Au NR Lösung am Tag 2 und inkubieren sie für weitere 24 Stunden. Die Partikel für den Kontrollexperimenten nicht hinzufügen. Hinweis: Als Alternative Steuerung kann mit Gold-Nanopartikeln mit einem gut differenzierten Spitzenabsorptionswellenlänge zu Vergleichszwecken 14 verwendet werden. Für eine einheitliche Zellverhalten, halten Sie die Zelldichte konstant und nicht die gut Oberfläche vor der Zellaussaat ändern. </li></ol> 3. Neuritenwachstum Enhancement <ol><li> Paarder Laser mit einem optischen Monomode-Faser (numerische Apertur = 0,13) und enden mit einem Faserverbinder (FC-Anschlüsse sind praktisch und allgemein verfügbar ist). Messen Sie die Ausgangslaserleistung mit einem Standard-Leistungsmesser. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, passen Sie die Peak-Wellenlänge des Lasers auf die Plasmonresonanzspitze der NRs. </li><li> Am Tag 3 nach NR Inkubation, fixieren Sie die FC-Stecker an den Brunnen. Bestrahlen Proben und Kontrollen bei RT für 1 min im Dauerstrich, für unterschiedliche Laserleistungen. Ermöglichen die Kultur für 3 weitere Tage bei 5% CO 2/37 ° C ablaufen. Wiederholen der Laserbestrahlung für ein Minimum von 3 unabhängigen Messungen. Anmerkung: Verschiedene Bestrahlungszeiten und Impulsfrequenzen können ausgewählt werden, abhängig von der Anwendung. </li><li> Charakterisieren Sie den Laser in Bezug auf die Strahldurchmesser und Laserbestrahlungsstärke (W ∙ cm -2). <ol><li> Bei einer Standard-Singlemode-Faser, verwenden NA = n ∙ sin θ,wobei n der Brechungsindex des Mediums, in Gebrauch und θ ist der Halbwinkel des Konus von Licht aus der Faser austretenden (siehe 1A). Von Trigonometrie r = tan θ ∙ d, wobei r der Radius des Laserstrahls ist und d der Abstand zwischen der Faser und der Probe. Die FC-Stecker auf den Durchmesser des Bohrlochs daher Beleuchten der Probe in einem Abstand d = 2,70 ± 0,20 mm. Licht tritt aus der Faser in Wasser (n = 1,33), so dass r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d. </li><li> Verwendung der letzteren Gleichung errechnen Laserstrahlradius, die entsprechende Strahlfläche und die mittlere Laserbestrahlungsstärke (Laserleistung geteilt durch Strahlfläche) am Ziel (siehe Beispiel Diagramm in 1B). Diese Werte stellen den Durchschnitt Bestrahlungsstärke auf der beleuchteten Fläche. </li><li> Bewerten der Fehler bei den Messungen mit der allgemeinen Theorie der Fehlerausbreitung. Hinweis: Der Abstand bwischen der FC-Stecker und die Probe kann durch Fotografien der Versuchsanordnung und Nachverarbeitung des Bildes mit einer geeigneten Software (zB ImageJ) gemessen werden. </li></ol></li><li> An Tag 5, entfernen Zelldifferenzierungsmedium aus den Versuchen und fixieren die Proben mit 3,7% (v / v) Formaldehyd-Lösung für 10 min, dann permeabilisiert die Zellen mit 0,1% (v / v) Triton X-100 für 20 min. </li><li> Hinzufügen von 3% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) zu den Proben für 60 min, um das nichtumgesetzte Proteinbindungsstellen zu blockieren. Beschriften der Proben für Anti βIII -Tubulin über Nacht (5 ug / ml in PBS, ergänzt mit 1% BSA) bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen für 90 min im Dunkeln inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper (zB TRITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper) mit einer Konzentration von 0,4-2 ug / ml in 1% BSA in PBS. Kennzeichnen die Zellkerne mit DAPI (0,1 &amp; mgr; g / ml in deionisiertem Wasser) für 10 min. Hinweis: Antikörper-Konjugation und Konzentration might variieren je nach Firmenprotokoll. Wash Proben zweimal mit PBS für 5 Minuten nach jeder Färbung Bühne. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li> Bildproben durch Epifluoreszenz oder konfokaler Mikroskopie unter Verwendung von mindestens einem 20 × -Objektiv. Wähle das Mikroskop filtert entsprechend an den sekundären Antikörper. Wählen Sie eine DAPI-Filter (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm), um die Zellkerne zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Bilder von der Bewertung: i) die maximale Neuritenlänge (Rekord die Länge von der Spitze des Neuriten an den Anfang des Zellkörpers), ii) die Anzahl der Neuriten pro neuronalen Zell (Fassend alle Neuriten pro Zelle) und iii) der Anteil der Zellen mit Neuriten (teilen die Gesamtzahl der Zellen βIII-Tubulin exprimieren durch die Gesamtzahl von Zellen mit einem positiv gefärbten Kern) 19. </li></ol> 4. Laser-induzierter intrazellulärer Ca 2+ Imaging <ol&gt; <li> Vorbereiten einer 20% (w / v) Stammlösung von Pluronic F-127 durch Lösen von 2 g des gelösten Stoffes in 10 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO). Erhitzt man die Lösung von Pluronic F-127 bei 40 ° C für ungefähr 20 min, um die Löslichkeit zu erhöhen. Bereiten Sie im Voraus, wenn bei RT gelagert. </li><li> Am Tag 3 nach NR Inkubation, bereiten eine ausgeglichene Salzlösung (BSS, 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, 5,6 mM Glucose und 10 mM HEPES, pH 7,4) und ergänzt es mit 5 uM Fluo-4.00 in DMSO und 0,1% (w / v) Pluronic F-127-Lösung. Anmerkung: BSS Lösung kann vorher hergestellt und für höchstens 1 Monat im Kühlschrank gelagert werden. Hinzufügen der Ergänzungs (Fluo-4 Uhr und Pluronic F-127), am Tag des Experiments. </li><li> Entfernen Zelldifferenzierungsmedium und ersetzen Sie es mit dem BSS-Lösung ergänzt. Um die besten Ergebnisse mit einem invertierten konfokalen Mikroskop zu erhalten, Inkubation der Zellen in einem Mikroobjektträgers. </li><li> Last NG108-15-Zellen mit Fluo-04.00für 30 min im Dunkeln bei 5% CO 2/37 ° C. Nach der Inkubationszeit waschen Proben zweimal mit BSS jede extrazellulärem unbelastetem Fluorophor zu entfernen. </li><li> Koppeln der Laser mit einer Einmoden-Lichtleitfaser und spalten die Spitze unter Verwendung von Standardtechniken. Beachten Sie die resultierende Spitze unter einem optischen Mikroskop, um eine hochwertige Oberfläche gewährleisten (dh die Spitze sollte senkrecht zur Faserachse und flach auf Mikroskopie Inspektion). <ol><li> Messen Sie die Ausgangslaserleistung mit einem Standard-Leistungsmesser. Legen Sie die Lichtabgabe Faser in eine optische Faser Halter und befestigen Sie es an einen Mikropositionierer. Siehe Brown et al. 20 für weitere Informationen über Glasfaser Vorbereitung und Positionierung. Achtung: Beachten Sie die allgemeinen Regeln für die Lasersicherheit während der Messung der Laserleistung (zB schauen Sie nicht direkt in den Laserstrahl, Laserschutzbrillen tragen bei der Handhabung, verhindert Streulicht Exposition gegenüber anderen Labor-Benutzer) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li> Schließen Sie ein Oszilloskop an den tragbaren Laser, um die optische Modulation zu überwachen. Verwenden Sie ein binäres Signal mit variabler Frequenz (0,5-2 Hz) und Pulslängen (20-100 ms). Verbinden des Lasers unter Verwendung des Modulationssignals als Transistor-Transistor-Logik (TTL) Eingang für das Mikroskop, im Anschluss an die in Paviolo et al. 13 gezeigten Aufbau. <ol><li> Zeigen die Zellen unter einem umgekehrten Konfokalmikroskop und Positionieren des Lichtzuführungsfaser 250 ± 50 &amp; mgr; m entfernt von der Zielzelle im Transmissionsbeleuchtungsmodus. In dieser Entfernung mit Hilfe der Gleichungen präsentiert in 3.3.1, um die Strahlradius auf das Ziel zu berechnen. </li></ol></li><li> Verwenden eines Argon-Ionenlaser (488 nm), um den internalisierten Fluo-4.00 Farbstoff anzuregen (λ ex = 494 nm; λ EM = 516 nm) und der Synchron LD für die Anregung der Endozytose NRs. Führen die Abbildung bei RT von Proben und Kontrollen unter Verwendung von mindestens einem 40 × -Objektiv durch Sammeln von Zeitreihen Scansmit 256 x 256 Pixel / Rahmen Auflösung in Roundtrip-Modus mit einer Frequenz von mindestens 4 Hz. Führen einer Aufzeichnung ohne LD Anregungs jede Argon-Ionen-Laser-Interferenz (Grundrauschen) zu identifizieren. </li><li> Entfernen Sie den Hintergrund aus den Daten mit Hilfe adaptiv gewichtet bestraft Least-Squares-Algorithmus 21. Zeichnen Sie die induzierte Ca 2+ Änderungen als eine Funktion der Zeit. Analysieren Sie die Signalspitzen in der Fluoreszenzintensität mit Bildnachbearbeitungssoftware durch Schwellen auf einem Niveau, das Dreifache der Standardabweichung der Grundrauschen (3σ). </li></ol>

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Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Die in dieser Präsentation beschriebenen Protokolle beschreiben, wie Kultur, zu differenzieren und optisch zu stimulieren Nervenzellen mit extrinsischen Absorber. Die NR Eigenschaften (zB Abmessungen, die Form, Plasmonresonanzwellenlänge und die Oberflächenchemie) und die Laserstimulationsparameter (wie zum Beispiel Wellenlänge, Impulsdauer, Wiederholungsrate usw.) können variiert werden, um verschiedene experimentelle Bedürfnisse angepasst werden. Die Auswirkungen auf das Zellverhalten können mit Standard-biologischen Assays und Materialien überwacht werden. Insgesamt ist der Ansatz bietet eine einfache, aber leistungsfähige, Weg, um Zellpopulationen in vitro zu bestrahlen und könnte zu primären Zellen, Gewebeproben und in vivo Studien erweitert werden. Die wichtigsten Anforderungen, die Au NRs müssen genügen, um für biologische Anwendungen verwendet werden, sind Stabilität (sowohl chemische und physikalische) und Biokompatibilität. Letzteres ist insbesondere dann kritisch, wegen der Anwesenheit eines kationischen Tensids (commonly CTAB) auf der Oberfläche der Au. CTAB ist bekannt, Zytotoxizität in vitro 28 und 29 in vivo zu induzieren, und es wird üblicherweise bei der Synthese verwendet, um die NR-förmiger Formation 30 anzutreiben. Stabilität und Biokompatibilität werden oft durch Aufbringen zusätzlicher Beschichtungen auf dem Au NR Oberfläche (zB Polyethylenglycol, Siliciumdioxid) 31 verbessert. Um die Biokompatibilität zu bewerten, können verschiedene Tests in vitro verwendet werden (zB Live / Dead, MTS, MTT, etc.), während die histologische Analyse wird oft während der Gewebe Experimente 7,8,12,15 geführt. Eine weitere Herausforderung zu stellen, wenn Sie mit Nanomaterialien ist die Schwierigkeit der korrekten Bestimmung ihrer molaren Konzentration. Die Vielzahl von Nanopartikeln in Bezug auf Form, Größe und chemische Eigenschaften macht die Techniken derzeit nur für bestimmte Klassen von Teilchen geeignet. Zum Beispiel kann die Standard-dynamische Licht scattEring Methode geht davon aus, dass NPs eine sphärische Form und streuen das Licht isotrop 17. Daher Anwendung dieser Methode zu Au NRs ergibt Abweichungen zwischen der gemessenen Konzentration und die reale. Die Frage der NP-Konzentration ist besonders problematisch, wenn an die Nanobereich, wobei das verabreichte Konzentration muss präzise um die Wirksamkeit des Verfahrens (zB für die Arzneimittelabgabe-Anwendungen) zu maximieren und die Toxizität der Nanomaterialien 17 zu minimieren kontrolliert werden müssen. In den Studien, die hier berichtet, die optische Dichte verwendet, gute Ergebnisse in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Partikelzahl. Aufgrund ihrer intrinsischen Absorptionseigenschaften, Gold-Nanopartikel werden oft in Kombination mit einer Laserquelle verwendet. Während der Belichtung, Absorption und Streuung sind die beiden Hauptverfahren wahrscheinlich an der Oberfläche der Nanopartikel erfolgen. Wenn die Laserwellenlänge entspricht der Plasmon-Resonanz-Wellenlänge, Absorption oftVorrang vor Streuung, spannend die Leitungselektronen an der Oberfläche NP. Diese bilden ein Elektronengas, das sich von seiner Gleichgewichtsposition bewegt und erzeugt eine Resonanz kohärenten Schwingung genannte lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR). Die Energie wird dann zu der NP-Kristallgitter als Wärme, die danach schnell in die Umgebung 32 abgeführt wird übertragen. Da Wärme ist die nach der Erregung des NR LSPR beobachtete Haupteffekt ist es ratsam, die Lebensfähigkeit der Zelle, nachdem die Laserbelichtung zu überwachen. Es wurde vermutet, dass die beobachteten Effekte auf das Neuritenwachstum und die intrazelluläre Ca 2+ Wegs aufgrund der transienten Erwärmung aus Anregung des LSPR waren. Diese Hypothese ist in Übereinstimmung mit der Aktivierung des temperaturempfindlichen TRPV1 Kanal nach magnetischer Einwirkung von Ferrit NPs 5. Dieser Prozess ist auch im Einklang mit Beobachtungen, die thermisch empfindliche TRPV4 Kanäle play eine wichtige Rolle bei der Infrarot-Nervenstimulation 33. Auf molekularer Ebene wurde kürzlich gezeigt, dass TRPV4 ist thermo erst nach dem Zusammenwirken der Phosphoinositid -4,5 -biphosphate (PIP 2) mit dem Kanal 34. Daher ist es möglich, dass die transienten Erwärmung, die nach Anregung NR könnte dazu dienen, zu beschleunigen und / oder zu veranlassen das Öffnen der TRPV4 Kanälen. Freiem Medium und / oder Molekular Kontrollen des PIP 2 Verarmungs - diese Hypothese durch zukünftige Ca 2+ Experimente unter Verwendung Ca 2+ bestätigt werden. Verschiedene Gruppen haben auch gezeigt, dass kleine Temperaturgradienten über den physiologischen Temperaturbereich kann verwendet werden, um andere Reaktionen, wie neuronale Wachstumskegel Führung 25 oder depolarisierenden Ströme in humane embryonale Nierenzellen 35 zu induzieren. Yong und Mitarbeiter einen deutlichen Anstieg der elektrischen Signal-Aktivität in primären auditorischen Neuronen Kultfiguriert mit Silica-beschichteten Au NRs nach Laserbestrahlung der NRs am LSPR. Die von den laserbestrahlten Partikeln hergestellt Heizung wurde mit Patch-Clamp-Techniken 14 gemessen. In jüngerer Eom et al. Einen Anstieg in der Amplitude des Cnaps nach Laserbelichtung von 3,4 × 10 9 Au NRs wenn kontinuierlich in der Nähe der Hülle der Nervenbündel eines Ischiasnervs der Ratte 15 perfundiert. Die stimulierende Wirkung der während der Versuche beobachtet, 780 nm Laserdiode wurde nicht gebunden, die durch Wasserabsorption erzeugte Wärme, wie dies bekannt ist, bei 780 nm 36 vernachlässigbar. Früher veröffentlichten Ergebnisse wurden ebenfalls berichtet stimulatorischen Wirkungen von 780 nm Licht auf neuronale Gewebe in vivo 37,38. In vitro-Studien haben die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies in dem Prozess 39 gezeigt. Die detaillierten Mechanismen, durch die NIR-Stimulation wirkt sich jedoch Gen transcription und anderen zellulären Aktivitäten liegen noch ungelöst. Aktuelle Daten nahe, die Wechselwirkung der verschiedenen Effekte der Stimulation, einschließlich Absorptions Photon innerhalb Chromophore in den Mitochondrien 37,39-41 (nahezu 50% der Energie bei 780 nm können durch das Cytochrom-c-Oxidase absorbiert werden), Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit für Calcium 37 und die Hemmung der Entzündungsaktivität in den Zellen 37. Die Ergebnisse in diesem Manuskript vorgestellt zeigen, dass Nanopartikel-Absorber sind äußerst viel versprechend für zukünftige Anwendungen in der optischen Stimulation von Nervenzellen. Der große Vorteil liegt in der Fähigkeit der NIR-Licht, um in das Gewebe dringen tief (therapeutisches Fenster). Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Nanopartikel-Absorber können zu verbessern und / oder den Prozess der Infrarot neuronale Stimulation auf Basis von Wasseraufnahme ersetzen. Für zukünftige Anwendungen in der Neuroprothesen, wäre es von Interesse sein, unterschiedliche Oberflächen functionalizat untersuchenIonen mit chemischer Affinität für neuronale Axone, die die Hauptziele für viele optische Stimulationsanwendungen.

Jüngste Studien haben gezeigt, daß die Übergangserwärmung mit der Absorption von Infrarotlicht durch Wasser (Wellenlänge&gt; 1.400 nm) verbunden sind, können verwendet werden, um Aktionspotentiale in Nervengewebe 1 und intrazellulären Calciumtransienten in Kardiomyozyten 2 induzieren. Die Verwendung von Infrarotlicht hat großes Interesse für Anwendungen in der Neuroprothesen angehoben, aufgrund der potentiellen feinere räumliche Auflösung, Fehlen eines direkten Kontaktes mit dem Gewebe, Minimierung der Stimulationsartefakte und das Entfernen der Notwendigkeit, genetisch die Zellen vor der Stimulation verändern ( wie in Optogenetik erforderlich) 1. Trotz all dieser Vorteile, schlug kürzlich entwickelte thermische Modelle, dass die Zielgewebe / Zellen können durch kumulative Wärmeeffekte, wenn mehrere Konjunktur Websites und / oder hohen Repetitionsraten verwendet 3,4 berührt. Als Antwort auf diese Herausforderungen haben die Forscher das Potenzial, extrinsische absor zugelassenesglieder zur Nervenstimulation, mehr lokalisierte Erwärmungseffekte im Gewebe zu produzieren. Huang et al. Gezeigt, dieses Prinzip durch Verwendung superpara Ferritnanopartikel die temperaturempfindliche TRPV1 Kanäle in HEK 293 Zellen, die mit einem Hochfrequenz-Magnetfeld 5 Ferne zu aktivieren. Obwohl diese Technik für ein tieferes Eindringen zu ermöglichen (Magnetfelder in Wechselwirkung relativ schwach mit Gewebe) wurden die Reaktionen nur über einen Zeitraum von Sekunden aufgezeichnet, anstatt Millisekundendauer in bionische Vorrichtungen 5 erforderlich. Ähnlich Farah et al. Zeigten elektrische Stimulation kortikale Neuronen der Ratte mit schwarzen Mikropartikel in vitro. Sie zeigten zellgenau in Stimulation mit Pulsdauern in der Größenordnung von Hunderten von &amp; mgr; s und Energien im Bereich von &amp; mgr; J, potenziell ermöglicht eine schnellere Wiederholraten 6. Die Verwendung von extrinsischen Absorber wurde auch angewendet, um zu induzierenmorphologische Veränderungen in vitro. Ciofani et al. Zeigten eine Zunahme ~ 40% in neuronalen Zell Auswuchs mit piezoelektrischen Bornitrid-Nanoröhren durch Ultraschall 7 erregt. Ähnlich endozytosiert Eisenoxidnanopartikel in PC12-Zellen wurde berichtet, Neuriten Differenzierung in einer dosisabhängigen Art und Weise zu erweitern, die durch die Aktivierung von Zelladhäsionsmolekülen mit dem Eisenoxid 8. Vor kurzem hat das Interesse an der äußeren Absorber auf neuronale Stimulation unterstützen auch die Verwendung von Gold-Nanopartikeln (Au-NPs) konzentriert. Gold-Nanopartikel haben die Fähigkeit, Laserlicht effizient absorbieren an der Plasmonen Spitze und sie in die Umgebung in Form von Wärme 9 zerstreuen. Unter allen verfügbaren Partikelformen, die optische Absorption des Gold-Nanostäbchen (Au NRs) bequem passt das therapeutische Fenster von biologischen Geweben (Nahinfrarot - NIR- Wellenlänge zwischen 750-1,400 nm) 10. Darüber hinaus wird in der Fortsetzungext neuronaler Stimulation, die Verwendung von Au NRs bietet relativ günstige Biokompatibilität und eine breite Palette von Oberflächenfunktionalisierung Optionen 11. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine stimulierende Wirkung auf die Differenzierung nach der kontinuierlichen Laserbelichtungen Au NRs in NG108-15 neuronalen Zellen 12 induziert werden. In ähnlicher Weise wurden die intrazelluläre Calcium Transienten in neuronalen Zellen mit Au NRs nach der Laserbestrahlung mit variablen Frequenzen und impulsmoduliert Weiten 13 kultiviert aufgezeichnet. Zellmembran Depolarisation wurde auch nach NIR Laserbeleuchtung Au NRs in primären Kulturen von Spiralganglienneuronen 14 aufgezeichnet. Die erste in vivo-Anwendung mit bestrahlten Au NRs wurde erst kürzlich unter Beweis gestellt. EOM und Mitarbeiter ausgesetzt Au NRs an deren Plasmonenspitze und erfasst eine sechsfache Erhöhung in der Amplitude der Verbindung Nervenaktionspotentiale (Cnaps) und eine dreifache Verringerung der Reizschwelle in Rattenischiasnerven. Die enhanced Reaktion wurde die lokale Erwärmungseffekte von der Erregung des NR plasmonic Peak 15 resultierende zurückzuführen. In der vorliegenden Arbeit werden die Protokolle für die Untersuchung der Auswirkungen von Laserstimulation in NG108-15 neuronalen Zellen mit Au NRs kultiviert angegeben. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, Zellpopulationen in vitro Bestrahlung mit Standard-biologischen Techniken und Materialien. Das Protokoll basiert auf einem fasergekoppelten Laserdiode (LD), der einen sicheren Betrieb und reproduzierbare Ausrichtung ermöglicht. Die Au-NR Probenvorbereitung und Laserbestrahlungsverfahren kann weiter auf verschiedene Partikelformen und neuronalen Zellkulturen ausgedehnt werden, vorausgesetzt, dass die gezielte Synthese und Kultur Protokolle bekannt sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Au NR</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>716812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG108-15</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8811230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrometer</td>
			<td>Varian Medical Systems Inc.</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mini Spin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic bath</td>
			<td>Unisonics Australia</td>
			<td>FPX 10D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera Cell 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotofix 32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser diode</td>
			<td>Optotech</td>
			<td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>780 HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Laser Check</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>ImageX-press 5000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-slide well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td>
			<td>LSM 510 meta-confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Durch die Verwendung von hier beschriebenen Protokolle 1, 2 und 3 wurde eine stimulierende Wirkung auf die Differenzierung neuronaler NG108-15 Zellen mit Gold-Nanopartikeln kultiviert beobachtet (Au NRs, Poly (styrolsulfonat) beschichteten Au NRs und Siliciumdioxid-beschichteten Gold-NRs) nach der Laser Expositionen zwischen 1,25 und 7,5 W · cm -2. Konfokale Bilder von rhodamineB markierten Au NRs gezeigt, dass die Teilchen wurden von Tag 1 der Inkubation 12 internalisiert. Die Lokalisierung wurde vorwiegend im Zytoplasma der Zelle beobachtet, was zeigt, dass der bevorzugte Mechanismus der Aufnahme war über die Zellkörpermembran 12. Die wichtigsten morphologischen Veränderungen nach der Induktion der Differenzierung in NG108-15 neuronalen Zellen nachgewiesen wurden, waren die Festnahme der Proliferation, der Ausdruck der βIII-Tubulin-Protein und das Auswachsen von Neuriten, die in Bezug auf die maximale Länge und die Anzahl 22 analysiert wurden. Proben mit NRs kultiviert zeigte eine Neuritenlänge Anstieg am Laser irradirungs Ebenen hier gemessen (zwischen 1,25 und 7,5 W · cm -2). Kontrollproben (Zellen ohne NPs kultiviert und der Bestrahlung mit der gleichen Laserleistung) zeigten keine signifikante Längenänderung. Verwendung einer Bestrahlungsdosis von 7,5 W · cm -2, die endgültige Neuritenlänge der NG108-15 mit Au NRs kultiviert war etwa 36% höher (p &lt;0,01) als die nicht laser-bestrahlten Proben. Dieses Verhalten war nicht spezifisch an die Oberflächenchemie der NRs verbunden. Diese Werte waren fast 20% größer als die von NG108 entwickelt -15 allein und auf den gleichen Wert der Laserbelichtung (p &lt;0,05) 12 ausgesetzt Neuriten. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früher veröffentlichten Studien über PC12 neuronalen Zellen mit piezoelektrischen Nanotubes mit Ultraschallstrahlung 7 kultiviert und bestrahlt. Kontrollexperimente ohne Au NRs zeigte auch einige stimulierende Wirkung des 780 nm Licht in Prozent der Neuronen mit Neuriten und die Anzahl der neurites pro Neuron. Diese Stimulation war wirksamer bei niedrigeren Laserleistungen (1,25 W ∙ cm -2) mit einem anschließenden Rückgang auf höchstem Laserenergie (7,5 W ∙ cm -2) 12. Eine mäßige Stimulierung durch den NPs ohne Laserbestrahlung verursacht (Poly (styrolsulfonat) beschichteten und mit Kieselsäure beschichtete nur) wurde in dem Prozentsatz der Neuronen mit Neuriten 12 erfasst. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Beobachtungen, dass Gold-Nanopartikel können neuronale Aktivität in vitro 23,24 erhöhen, Fig. 2 zeigt ein Beispiel für Epifluoreszenz Bilder von differenzierten neuronalen NG108-15 Zellen alleine kultiviert (2A) oder mit Au NRs (2B ) und mit unterschiedlichen Laserleistungen (in der Figur angegeben) bestrahlt. Das Potenzial für die foto-erzeugten intrazellulären Ca 2+ -Freisetzung wurde mit gepulsten NIR-Licht in Übereinstimmung mit den Protokollen 1, 2 beurteilt, und4. Calciumionen spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellaktivitäten, wie beispielsweise die Mitose, Muskelkontraktion und die Neuritenextension 25,26. In Reaktion auf einen Reiz, Ca 2+ zunimmt, schwingt, und verringert, was zur Aktivierung, Modulation oder die Beendigung einer bestimmten Zellfunktion. Kürzlich wurden Ca 2+ Transienten auch als Folge von IR-Laserbelichtung in Kardiomyozyten beobachtet. In dieser Arbeit, evoziert der Ca 2+ Antworten nach IR Exposition zeigten geringere Amplituden und schnellere Recovery-Zeiten, als die spontane Ca2 + Transienten 2, Fig. 3 zeigt ein Beispiel für NG108-15 neuronalen Zellen mit Fluo-4.00 geladen und mit einem bebilderten konfokalen Mikroskop. Fluo-4.00 wurde beobachtet, um die Zellmembran in einer nicht-störenden Weise gelangen können, was in einer im Wesentlichen gleichmäßige Verteilung des Indikators in das Cytoplasma der Zelle. Nur geringe Kern oder cytoplasmatische Organelle Färbung wurde erkannt. Wie zuvor angedeutetWurden NRs erwartet intrazellulär 12 angeordnet sein. NG108-15 neuronalen Zellen allein oder mit Au NRs und Poly (styrolsulfonat) kultiviert -beschichteten-Au NRs wurden danach mit Laserbestrahlungen ausgesetzt zwischen 0,07 J ∙ cm -2 und 370 J ∙ cm -2, mit der Laserfrequenz im Bereich modulierten von 0,5-2 Hz. Abbildung 4 zeigt repräsentative Beispiele, wie die Amplitude der Antworten wurde als Funktion der Zeit abgebildet. Die Amplitude des Ca 2+ Antwort mit der Bestrahlung (4A - C) variiert, und wurde nicht beobachtet, konsequent von den Laserpulsen (4C) 13 ausgelöst werden. Die wahrscheinlichste Erklärung waren die vorübergehende Erschöpfung der intrazellulären Ca 2+ speichert unvollständigen Ca 2+ Lade 2 oder der unterschiedlichen Effizienz der NR Internalisierung in den neuronalen Zellen zurückzuführen. Wenn NRs nicht in cultur verwendete (Kontrollversuche, 4D) wurde eine stimulierende Wirkung des 780-nm-Licht beobachtet. Jedoch wurden in diesem Zusammenhang unteren Fluoreszenzamplitudenspitzen und geringere Wahrscheinlichkeit der Aktivierung (nur bei 16% der untersuchten Proben gefunden). Insgesamt eine 48% Wahrscheinlichkeit des NR Laser-induzierte Zellaktivierung wurde erreicht und trotz der Untergrundereignisse aufgrund der 780-nm-Licht, Belichtung des NR-behandelten Zellen zeigten höhere Stimulationseffizienz mit geringeren Laserenergie und höhere Gipfel der Antwort 13. In der Tat, die Calcium-Reaktion auf Peak bei 0,33 J ∙ cm -2 in der NR-behandelte Zellen gefunden wurde. Dieser wurde einer thermischen Inhibierung 13 zurückzuführen. Während der Experimente wurden keine Beweise für blebbing oder jeder anderen Form der Zellmembran Störung detektiert, was konsistent mit den Ergebnissen von Huang et al., Die zelluläre Photozerstörung mit einer relativ hohen Leistungsdichte von 19 W ∙ cm angegeben -2 4 angewendet min 27. Keine Spontanaktivität in den NR-behandelten Zellen wurde ohne Laserbelichtung aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /> Abbildung 1: Glasfaser Versuchsaufbau (A) und die mittlere Laserbestrahlungsstärken in Abhängigkeit von der Laserleistung für einen Laserstrahl der Fläche ist gleich 0,4 mm 2 (B). Strahlparameter sind: (A) der Halbwinkel der maximalen Lichtkonus aus der Faser austretenden (θ), der Strahlradius (r) und des Abstandes zwischen der optischen Faser und der Probe (d). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiele für Epifluoreszenz Bilder von differenzierten neuronalen Zellen NG108-15 allein (A) kultiviert oder mit Au NRs (B) und mit unterschiedlichen Laserleistungen (in der Figur angegeben) bestrahlt. Die Proben wurden ieinen Tag vor der Laserbestrahlung ncubated. Die Zellen wurden fixiert und für die anti-β-III-Tubulin (rot) und DAPI (blau) drei Tage nach der Laserbestrahlung markiert. Maßstabsbalken sind 100 um. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiel differenzierter NG108-15 neuronalen Zellen mit Fluo4-AM Ca 2+ Anzeige geladen Das Bild wurde unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 40x Ölimmersionsobjektiv aufgenommen.. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Beispiele für laserinduzierte Ca 2+ Änderungen als eine Funktion der Zeit in NG108-15 neuronalen Zellen in einem serumfreien Bedingungen für drei Tage kultiviert (A) Poly (styrolsulfonat) -Au NRs, (B, C) Au NRs, und (D) ohne NRs (Kontrollprobe). Diese Ergebnisse warenmit Laserpulsen von 100 msec (A, C, D) und 50 ms (B) erhalten. Die für die Versuche (gestrichelte vertikale Linien) verwendeten Frequenzen waren 1 Hz (A - C) und 0,5 Hz (D). Die berechneten Strahlungsrisiken waren 69,4 J ∙ cm -2 (A), ∙ 34,7 J cm -2 (B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) und 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 die in NG108 -15 neuronalen Zellen erkannt maximale Fluoreszenzanstieg, aus Kalibrierung mit Ionomycin (mit Genehmigung 13 wiedergegeben).

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Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Aufrufe.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Serie: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...