Dieses Protokoll ist wichtig, weil es quantitativ phagozytose von markierten Aspergillus Fumigateurs Conidia durch menschliche Leukozyten, zusammen mit der Bindung von Conidia an Zellen, und Mangel an Interaktion durch Durchflusszytometrie misst. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie die schnelle Analyse einer großen Anzahl von Zellen erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht die Etikettierung der Zellmarker eine getrennte Bewertung von Neutrophilen und Monozyten innerhalb derselben Probe.
In jeder dieser Technik kann verwendet werden, um andere klinisch relevante Pilze wie Mucorales zu analysieren. Stattdessen könnten rote Blutkörperchen als Phagozyten verwendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie ein Papiertuch mit Desinfektionsmittel und legen Sie es in einen Bio-Sicherheitsschrank.
Legen Sie eine Platte mit gewachsenem Aspergillus fumigatus auf das Papiertuch, um eine Überverteilung von flüchtigen Conidia zu verhindern. Fügen Sie 10 Milliliter PBS mit 0,01% Waschmittel auf den Pilz, und verwenden Sie einen Drigalski Spachtel, um die Flüssigkeit über die Platte zu verteilen, und reiben Sie die dunkel gefärbte Conidia. Übertragen Sie die Conidia-Suspension mit einem 30-Mikrometer-Sieb auf 50 Milliliter, wodurch restliche Mycelia entfernt werden.
Fügen Sie weitere 10 Milliliter PBS mit Reinigungsmittel auf die Platte, verteilen Sie es mit einem Spachtel und übertragen Sie es in das gleiche Rohr durch das Sieb. Als nächstes bereiten Sie eine sterile Lösung von 0,1 molaren Natriumcarbonat, in PBS gelöst. Und bereiten Sie eine 0,1 Millimolar Lösung von FITC Pulver, in dieser Natriumcarbonat-Lösung.
100 Millionen oder weniger Conidia in fünf Millilitern dieser FITC-Lösung in einem 15 Milliliter-Rohr wieder aussetzen. Inkubieren Sie in einem Rotator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Um conidia anzuschwellen, setzen Sie das FITC mit der Bezeichnung Conidia in fünf Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 10%FCS, wieder auf.
Und in einem Rotator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit inkubieren. In einem Bio-Sicherheitsschrank fünf Milliliter Buffy-Mantel in ein 50-Milliliter-Rohr geben. Füllen Sie das Rohr mit EL-Puffer, und invertieren Sie dreimal.
Horizontal für fünf bis acht Minuten inkubieren, bis das milchige Aussehen der Mischung klar wird. Dann Zentrifuge bei 300 mal G, und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter EL-Puffer durch Pipettieren wieder auf.
Fügen Sie weitere 24 Milliliter EL-Puffer hinzu und invertieren Sie das Rohr mehrmals. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter RPMI-Medien wieder aus, ergänzt durch 10%FCS.
Zunächst werden zwei Millionen Leukozyten und vier Millionen FITC-gekennzeichnete Conidia in 1,5 Milliliter RPMI, ergänzt mit 10%FCS, auf eine 12-Well-Kulturplatte übertragen. Schließen Sie eine Steuerung von Zellen nur ohne Conidia und eine Steuerung von Zellen mit nicht beschrifteter Conidia ein. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator, bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu ernten, und übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter-Rohr. Legen Sie zunächst 100 Mikroliter jeder Probe und Kontrollen in einen Brunnen einer 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zum Waschen hinzu.
Zur Farbkompensation eine Million Zellen ohne Conidia für jede Farbe, in anderen Brunnen der Platte platzieren. Schließen Sie einen Brunnen von Zellen ein, die nicht trainiert werden. Fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zu jedem Brunnen zum Waschen hinzu.
Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebefolie und Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Folie und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und gewaltsam nur einmal über dem Waschbecken oder einem Einweg-Papiertuch umkehren. Setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Antikörper-Mix, und mischen Sie gut durch Pipettieren.
Für Farbkompensationen die jeweiligen Zellen in 100 Mikroliter PBS, die zwei Millimolar EDTA enthalten, wieder aussetzen und jedem Bohrkörper einen einzigen Antikörpertyp hinzufügen, in der gleichen Menge, die in der Antikörpermischung verwendet wird. Mit einer Klebefolie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln 20 Minuten bebrüten. Danach entfernen Sie die Folie und fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zu jedem Brunnen zum Waschen hinzu.
Bedecken Sie die Platte erneut mit Klebefolie. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Folie, und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und kraftvoll über ein Waschbecken oder ein Einweg-Papiertuch umkehren.
Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter PBS mit 2 Millimolaren EDTA aus und übertragen Sie die Zellsuspension von jedem Brunnen in ein separates rundes Unterrohr. Starten Sie das Durchflusszytometer, und lassen Sie es aufwärmen. Erstellen Sie in der Erfassungssoftware ein neues Experiment, richten Sie die neuen Beispiele ein und beschriften sie.
Richten Sie die Parameter und Detektoren für die entsprechenden Fluorophore ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Zeigen Sie in dieser Software die entsprechenden Punktdiagramme an, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit den Zellen nur Probe, erfassen einige Zellen und setzen Sie das Tor um Leukozyten.
Basierend auf dem Leukozytentor, Tor für CD45-positive Zellen, um sich von Conidia im SSC CD45-Plot zu trennen. In einem Punktdiagramm, CD14, CD66b, Gate Neutrophilen und Monozyten separat. Danach wechseln Sie von den Zellen nur Probe, zu unbeschrifteten Conidia.
In einem Punktdiagramm zeigen Anti-FITC, APC FITC Neutrophile in eingestellten Quadranten für Anti-FITC- und FITC-Signale an. Öffnen Sie die Statistikansicht, und passen Sie die Quadranten an, sodass maximal 1 % der Zellen in den Quadranten Q1, Q2 und Q4 angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Monozytentor. Zeichnen Sie im Leukozytentor alle Proben mit mindestens 20.000 Ereignissen auf.
Phagozytose von FITC-markierten Conidia durch menschliche Neutrophile kann aus den Statistiken ansichten gelesen werden. In dieser Studie wird eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode verwendet, um die Wechselwirkung von Aspergillus-Fumigateurs Conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten zu messen. Unter Verwendung der entsprechenden Antikörper und der hier gezeigten Gating-Strategie folgt auf eine allgemeine Vermischung menschlicher Leukozyten durch FSC- und SSC-Eigenschaften eine Trennung von Leukozyten in freier Conidia durch den Pan Leukozytenmarker CD45.
Conidia kann zum Zeitpunkt der Durchflusszytometrie fast zellgroße Personen erreichen, insbesondere bei Verwendung von geschwollenem Conidia und oder langen Inkubationszeiten, und kann uns somit eine Analyse kaufen. Da menschliche primäre Monozyten und Neutrophile Conidia unterschiedlich einnehmen, ermöglicht dieses Protokoll die getrennte Analyse dieser Zellpopulation basierend auf der Färbung mit den etablierten Zelllinienmarkern, CD14 für Monozyten und CD66b für Neutrophile. Der Prozentsatz der menschlichen primären Phagozyten, die Conidia verinnerlichen, kann unter den Blutspendern sehr variabel sein, hängt aber auch von experimentellen Faktoren wie Inkubationszeit und Schwellungszustand von Conidia ab.
Sporeninternalisierung kann nach 0,5 Stunden Ko-Inkubation erkannt werden, und erhöht sich mit der Zeit. Vorgeschwollene Conidia werden auch bei kurzen Inkubationszeiten leichter aufgenommen als ruhende Sporen. Wenn Conidia mit Formaldehyd fixiert sind, wird Phagozytose im Vergleich zu nativen Conidia vermindert.
Nach diesem Verfahren können Überstand von ko-inkubierten Immunzellen und Conidia von Eliza gesammelt und analysiert werden, um zu überprüfen, ob die Wechselwirkung eine Zytokinfreisetzung durch die Immunzellen hervorruft. Bitte denken Sie daran, dass menschliches Blut möglicherweise Infektionskrankheiten übertragen kann. Diese Arbeit erfordert eine Impfung über Hepatitis B, die Verwendung eines Bio-Sicherheitsschranks sowie das Tragen von Handschuhen an einem Labormantel.
