Name: assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Institute of Allergy and Infectious Disease Zuschuss R01AI079253 (BHS) unterstützt und von der National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016056 nach Roswell Park Cancer Institute.

Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften. 1. In-vivo-Makrophagen-Labeling Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für in vivo-Markierung verwendet, um die Menge der nach der Ernte Manipulation der Makrophagen zu minimieren. PKH-26 hat den Vorteil, stabil zu der sich in alveolären Makrophagen während längerer Zeit. Warten Sie 10 Tage nach der Verabreichung ermöglicht Clearance von allen markierten Zellen aus dem Verkehr so dass nur Alveolarmakrophagen stabil beschriftet mit PKH26 8, 9. PKH26 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Anregung (551 nm) und Emission (567 nm) hat Eigenschaften kompatibelmit Rhodamin oder Phycoerythrin Detektionssysteme. Jede Markierungsverfahren kann Artefakt vorstellen, einschließlich Verlust der Lebensfähigkeit. Da wir den gleichen Ansatz für die Kennzeichnung von Makrophagen in verschiedenen Maus-Genotypen (zB WT vs NADPH-Oxidase-Mangel), die Auswirkungen dieser Artefakte wäre Uniform. <ol><li> Verdünnen Stammlösung von PKH26 (1 x 10 -3 M in Ethanol) 1:5 in Verdünnungsmittel C durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. </li><li> Last 100 ul verdünnt PKH26 in einem 1/2 ml Insulin-Spritze (29 G x 1/2 &quot;) für jede Maus. </li><li> Verabreichen Mäusen durch iv-Injektion (entweder Schwanzvene oder retro-Orbital) mindestens 10 Tage vor der Ernte. </li></ol> 2. Ernten Alveolarmakrophagen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) Die Anzahl der Mäuse, für ein Experiment können variieren. Eine typische Ausbeute aus einer nicht-stimulierten Maus ist im Bereich von 3-5 x 10 5 Alveolarmakrophagen, aber diese Zahl kann stark variieren based von Faktoren wie Größe des Maus Erfahrung der Person, die die Spülung und die Anzahl der Instillation von Spülflüssigkeit und das Volumen von Lungen entnommen. In diesem Protokoll Lungenspülung mit einem geschlossenen Brusthöhle, die zusammen mit 1 ml Spülungen wiederholt hilft, die Zellausbeute zu erhöhen geführt. <ol><li> Euthanize Maus durch Verabreichung einer tödlichen Dosis des Narkose Avertin (12,5 mg) intraperitoneal (ip) unter aseptischen Bedingungen, um die Lösung steril zu halten. </li><li> Spray Maus gründlich mit 70% igem Ethanol. </li><li> Entfernen der Haut aus dem kranialen Ende tierischen Aussetzen des Thorax (Fig. 1A). <ol><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut direkt unterhalb des Zwerchfells. </li><li> Legen Sie den Finger in den Ausschnitt und ziehen die Haut von der Schädel Ende des Tieres (Abb. 1A). </li><li> Drücken Sie leicht auf den Kopf, Erweiterung der Bauchseite des Halses (Abb. 1A). </li></ol></li><li> Schneiden Sie ein kleines Loch in den Brustkorbin die rechte Seite des Brustkorbs, die Lungen entleeren und erlauben auch die Visualisierung der Lungen während der folgenden Schritte. </li><li> Suchen Sie die Luftröhre, und sorgfältig sezieren entfernt umgebende Gewebe. <ol><li> Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Muskeln und M. sternohyoideus Kehlkopf, etc. mit einer gebogenen Pinzette. </li><li> Vorsichtig mit einem gebogenen Pinzette heben und schneiden mit einer Schere die für den Luftröhre (Adventitia) enthüllt die zugrunde liegenden beringt Knorpelstruktur dünne Gewebe. </li></ol></li><li> Legen Katheter in die Luftröhre. <ol><li> Mit einer gebogenen Pinzette, legen Sie einen Faden hinter (dorsal) der Luftröhre und ziehen einen 10 cm Länge durch die Öffnung. </li><li> Ab über dem Ring (die Verdickung der Knorpelring) vorsichtig führen einen 22-G-Katheter der Luftröhre nach unten zu stoppen, wo die Luftröhre verschwindet hinter dem Brustbein. </li><li> Fest binden Naht um Luftröhre und Katheter für eine eng anliegende Passform. Entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter. </li></ol></li><li> Montieren 4-Wege-Hahn. <ol><li> Fülleneine 6-ml-Spritze mit DPBS, 1% FBS und heften sich an 4-Wege-Hahn, wie in 1B angegeben. </li><li> Bringen Sie eine leere 6-ml-Spritze an der angegebenen Position auf der 4-Wege-Hahn (Abbildung 1B). </li><li> Bringen offenen Port auf dem 4-Wege-Hahn zum Katheter (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, Katheter aus der Luftröhre nicht zu lösen. </li></ol></li><li> Sammeln Spülflüssigkeit aus der Lunge. Hinweis: Die Ermittler können sich für geringere Volumina an Waschflüssigkeit verwenden, um die Möglichkeit einer Schädigung des Gewebes zu minimieren. Es ist wichtig, dass der gleiche Ansatz konsistent in allen Mausgruppen angewendet werden. <ol><li> Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die leere Spritze geschlossen und langsam injizieren ~ 1 ml DPBS, 1% FBS Lungen aufzublasen. Beachten Lungen Inflation durch das Loch geschnitten in Schritt 2.4. </li><li> Achten Sie darauf, um die Lungen overinflate. </li><li> Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die volle Spritze geschlossen ist, und ziehen Sie vorsichtig die Grippe<html> id aus der Lunge. </li><li> Beachten Sie die Lunge durch das Loch geschnitten in Schritt 1.4 entlüften. Der Katheter kann brauchen, um etwas vor oder zurück bewegt werden, um einen guten Zug zu bekommen. Besondere Vorsichtsmaßnahme, um den Katheter in die Luftröhre zu halten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1-2.8.4 5-6x bis alle DPBS, 1% FBS wurde injiziert und aus den Lungen entnommen. Hinweis: Erholung der Lungenflüssigkeit nicht 100% der injizierten Flüssigkeit. </li></ol></li><li> Leere Spritze mit Spülflüssigkeit in einem 50 ml konischen Röhrchen. Halten Zellen bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand abgießen. Dies kann beispiels Zytokinanalyse falls gespeichert werden. </li><li> Die Zellen in 5.1 ml RPMI 1640 mit 10% FBS und zählen auf eine Zählkammer. In der nicht stimulierten Maus&gt; 95% der Zellen durch BAL geerntet werden erwartet, Makrophagen, die zytologisch bestätigt werden kann. </li></ol> 3. Kultivierung und Ernte Pilz &quot;&gt; Die in diesem Protokoll verwendet Aspergillus fumigatus drückt GFP in allen Phasen des Lebenszyklus:. Sporen, Keimlinge und Hyphen Diese Pilzstamm wurde von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada bereitgestellt. <ol><li> Platte Konidien von Aspergillus fumigatus, die GFP-Stamm auf Sabouraud-Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Schrägkulturen mit Chloramphenicol (0,05 g / l) und Gentamycin (0,5 g / L). </li><li> Im Dunkeln lose für 7 bis 10 Tage bei Raumtemperatur verschlossen. </li><li> Ernte Konidien durch Waschen Schräg mit 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Leicht kratzen den Pilz mit der Stripette zu lockern. Spülen Sie mehrmals die Schräge, um die Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Geben Konidiensuspension durch ein 100 &amp;mgr; m-Zellsieb in ein 50-ml-Erlen. </li><li> Pellet Konidien durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min. </li><li> Resuspendieren Konidien in 50 ml DPBS und zählen mit einer Zählkammer. </li><li> Zweimal waschen mit DPBS verdünnt und auf die gewünschte Konzentrationtration. </li></ol> 4. Pilz Herausforderung und konfokale Mikroskopie Um die Rolle von Makrophagen-NADPH-Oxidase der Wirtsabwehr zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der isolierten alveolaren Makrophagen von Mäusen, die drei Genotypen, um das Wachstum von Aspergillus-Sporen phagozytiert Steuerung ausgewertet. Die in dieser Studie verwendeten Genotypen umfassen; 1) Wildtyp-Mäusen, 2) NCF1 * / * Mn-Mäuse mit einem natürlich vorkommenden NCF1 Mutation (NCF1 kodiert für p47 phox, eine erforderliche Komponente des Phagozyten NADPH-Oxidase) verlassen sie NADPH-Oxidase-Mangel, und 3) NCF1 * / * Mn + transgenen Mäusen (MN bezeichnet das Transgen beherbergen NCF1 Wildtyp unter der Kontrolle des humanen CD68-Promotor) wo NADPH-Oxidase-Aktivität wurde in der Monozyten / Makrophagen-Population 10, 11 wieder hergestellt ist. Konfokalen Mikroskopie ist für diesen Test geeignet sind aufgrund des Vorhandensund das Wachstum von nicht-phagozytierten Konidien auf den Folien. Das konfokale Mikroskop wird zur Visualisierung der einzelnen Ebenen in der Z-Achse zu ermöglichen, und ermöglichen die Differenzierung zwischen Pilz wächst um als innerhalb Makrophagen. Alle konfokale Bilder werden mit einem 63X Ölimmersion erworben. Z-Stapel sind mit einem elektronischen Zoom-Faktor von 2,5 erworben. Die Dicke einer Z-Stapel wird mit DAPI und Hellfeld-Bilder, um die Ober-und Unterseite des Feldes zu finden bestimmt. Z-Stapel reichte von 14 bis 24 um mit einzelnen Scheiben ~ 1 um dick. Zur Quantifizierung der Makrophagen, wurden einzelne Scans von 1X elektronische Zoom auf 10 Felder pro Genotyp durchgeführt. Intakten Makrophagen wurden basierend auf PKH26 und DAPI-Färbung der Membran und Kern bzw. identifiziert. Konidien wurden auf der Grundlage FITC-Expression und Hellfeldbild identifiziert. <ol><li> Bereiten Sie sterile Deckgläser und Teller <ol><li> Unter einem biologischen Sicherheitsschrank, genießen 22 x 22 mm Deckgläschen in 70% Ethanol für 5-10 min. </li><li> Spülen Deckgläser in sterilem PBS. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig legen Sie eine einzelne Deckglas im Boden jeder Vertiefung einer sterilen einzeln verpackt 6-Well-Platte. </li></ol></li><li> Samen ~ 1 x 10 6 geerntet PKH26 markiert alveolären Makrophagen in 300 ul RPMI 1640 10% FBS auf jedes Deckglas. Die genaue Zahl kann je nach Erntemenge variieren. </li><li> Makrophagen zu ermöglichen, durch Inkubation bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht anhaften. </li><li> Am folgenden Morgen, fügen ~ 1 x 10 7 GFP-exprimierenden A. fumigatus Konidien in 100 &amp;mgr; l vorgewärmtes (37 º C) RPMI 1640, 10% FBS suspendiert. </li><li> Das Rückplatte auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Zellen sollten für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C fixiert werden Bei 3, 7 und 14 Stunden fix Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2% Formaldehyd in jede Vertiefung (Endkonzentration 1% Formaldehyd). Platz Platten für diefrühen Zeitpunkten bei 4 ° C über Nacht. Für die endgültige Zeitpunkt (14 h), fix Zellen bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Nach der Fixierung vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, Deckgläser und spülen in DPBS. </li><li> Überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem der Rand des Deckglases auf einem gefalteten Kimwipe. </li><li> Bewerben 6 ul Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Glasobjektträger. </li><li> Legen Sie eine Kante des Deckglases auf dem Objektträger und sanft fallen mit der Zellseite nach unten in die Montage Medium. Montagemedium verteilt und bilden eine gleichmäßige Schicht unter der Deckglas. Es gibt keine Notwendigkeit, sich auf dem Deckglas gedrückt wird. </li><li> Siegel Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack und an der Luft trocknen. </li><li> Shop vorbereitet Träger in einen Objektkasten (lichtgeschützt) bei Raumtemperatur, bis Sie sie durch konfokale Mikroskopie analysieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense.">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice.">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages.">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li><li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly.">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li><li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE.">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li><li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species.">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li><li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections.">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li><li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages.">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li><li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival.">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Gonz&#225;lez-Camacho, F., Rodr&#237;guez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes,+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing.">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li><li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+from+C3H/HeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin.">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. 4 fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidi...

Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe 5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen 6, 7. Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren. &lt;/ P&gt; Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. catheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-way stopcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges (4 inch square)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>heat inactivated</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatous&lt;/em&gt; strain expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C, 5%&amp;nbsp; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>glass coverslips</td></tr><tr><td>6-well Cell culture plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td><td></td><td></td><td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td></tr></tbody></table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.

<html> Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem&gt; 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen we...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Aufrufe.  Roswell Park Cancer Institute.  Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten. 

Serie: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Forschung

Biotechnik

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Immunologie und Infektion

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Medizin

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

Effizienz der Pilzbeseitigung von Makrophagen

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial phagocytosis is a key process that allows for the investigation of the cytoplasmic and molecular events involved in macrophage-pathogen interactions, as well as for the determination of the time of death of internalized conidia. The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The evasion of phagocytosis and escape of phagosomes are mechanisms of fungal virulence. Here, we report the methods that can be used for the analysis of the phagocytosis, clearance, and viability of T. stromaticum conidia, a fungus which is used as a biocontrol and biofertilizer agent and is capable of inducing human infections. The protocol consists of 1) Trichoderma culture, 2) washing to obtain conidia, 3) the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the polysucrose solution method and the differentiation of the PBMCs into macrophages, 4) an in vitro phagocytosis method using round glass coverslips and coloration, and 5) a clearance assay to assess the conidia viability after conidia phagocytosis. In summary, these techniques can be used to measure the&#160;fungal clearance efficiency of macrophages.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung des Zusammenspiels zwischen Trichoderma stromaticum und dem Immunsystem von Säugetieren

The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The purpose of this manuscript is to present a method for evaluating the phagocytosis and clearance abilities of human peripheral blood mononuclear-derived macrophages stimulated with Trichoderma stromaticum conidia.

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes