Dem extrazellulären Vesikelfeld fehlte es an genetisch beschreibbaren Wirbellosen, um die Protein- und RNA-Signale extrazellulärer Vesikel zu untersuchen. Dieses Protokoll legt die Methoden zur Gewinnung reichlich, reine extrazelluläre Vesikel von C.elegans. Dies reicht für eine robuste RNA-SEQ- und proteomische Analyse.
Wenn die synchronisierten Kultur C.elegans die Nahrung von ihrer normalen Wachstumsmediumplatte erschöpft haben, verwenden Sie Gummibänder, um eine fünf Mikrometer Nylon-Netzfilterkappe auf einer sterilen Flasche zu befestigen und ein Vakuum zu starten. Gießen Sie die L1-Würmer auf den Filter und übergeben Sie ein gleiches Mediumvolumen über die Schneckenaggregate. Nach dem Wirbeln drei 10 Mikroliter Volumen der Wurmsuspension auf einen Wurmanbauplattendeckel übertragen und die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen zählen.
Stellen Sie die Wurmsuspension auf zwei Tiere pro Mikroliter frisches Medium ein und wirbeln Sie die Suspension erneut aus. Als nächstes fügen Sie neun, 10 Mikroliter Tropfen Würmer auf einen neuen Plattendeckel und manuell zählen die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen. Berechnen Sie dann den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts als Prozentsatz jeder Wurmpopulation und berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere in jeder Population.
Um die Würmer für die Sekretik-Generation vorzubereiten, waschen Sie die Würmer mit drei fünfminütigen Waschungen in 15 Milliliter sterilem M9-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin pro Platte pro Waschplatte mit sanftem Wirbeln, um die Würmer zu lösen, und bündeln die Wäschen in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Nach der letzten Wäsche die Würmer auf ein Tier pro Mikroliter S-Basel-Lösung verdünnen, ergänzt mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Cholesterin und 50 mikromolarem Carbenicillin. Dann fügen Sie bis zu 400 Milliliter der Schneckensuspension zu einem sterilen Zweiliter Boden verwirrt Kolben.
Stellen Sie den Kolben 24 Stunden lang auf einen kreisförmigen Rotator bei 20 Grad Celsius und 100 Umdrehungen pro Minute. Für die extrazelluläre Vesikelernte die Würmer in einem 50 Milliliter konischen Rohr zur Zentrifugation übertragen und den Überstand durch einen 0,22 Mikrometer-Vakuumfilter dekantieren, um Partikelzustände zu entfernen. Legen Sie nach dem Zählen einen Tropfen hängender Würmer auf einen bakteriellen Rasen und bewerten Sie die Tiere nach 15 Minuten als bewegend, gelähmt oder tot.
Als nächstes konzentrieren Sie den gefilterten Überstand auf 700 Mikroliter mit einem regenerierten Nitrocellulose 10 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Filter und fügen 150 Mikroliter frische S-Basel-Lösung zur Reduktion hinzu. Filtern und wirbeln Sie die resultierende Lösung und wiederholen Sie die Reduktion und Filtration zwei weitere Male, wie gerade gezeigt. Zentrifugieren Sie nach der letzten Filtration den Überstand, um Partikel und Schmutz zu entfernen, die sich während der Handhabung angesammelt haben könnten, und fügen Sie Protease-Hemmer-Cocktail plus EDTA gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.
Um die Größenausschlusssäule vorzubereiten, dekantieren Sie 15 Milliliter aufgehängtes Agaroseharz in eine leere Schwerkraftflusssäulenpatrone. Wenn die Säule entleert ist, fügen Sie die S-Basel-Lösung hinzu, bis das Harzbett mit einem Endvolumen von 10 Millilitern verpackt ist. Ersetzen Sie den Harzpuffer durch 40 Milliliter steril gefilterte S-Basel-Lösung, wobei darauf geachtet wird, das Harz nicht zu stören, und die Schwerkraft den Puffer durch die Säule entleeren kann.
Sobald die Oberseite des Harzes nicht mehr untergetaucht ist, verriegeln Sie den Boden der Patrone, um den Fluss zu stoppen, und legen Sie ein Sammelrohr unter die Säule. Um die Sekrezfraktionierung zu initiieren, entfernen Sie die Kappe und fügen Sie die konzentrierte Geheimlösung sofort tropfenweise an die Oberseite des Säulenbettes, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter S-Basel Lösung tropfenweise. Legen Sie ein frisches Sammelrohr unter die Säule und füllen Sie langsam das obere Säulenreservoir mit fünf Millilitern S-Basel-Lösung.
Nach dem Sammeln der ersten zwei Milliliter Eluat, schnell die Rohre wechseln, um die nächsten vier Milliliter zu sammeln. Verwenden Sie einen regenerierten Nitrocellulose 10 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Spin-Filter, um das extrazelluläre Vesikel, das Dassäuleneluat enthält, auf 300 Mikroliter zu konzentrieren und das Filterretenin in ein niedrig bindendes Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Dann die Filtermembran zweimal mit 100 MikroliterS S-Basel-Lösung bei 20 Sekunden Wirbel pro Waschgang waschen und die Wäsche mit dem Originalretentat für ein endgültiges Probenvolumen von 500 Mikrolitern kombinieren.
Um die extrazellulären Vesikel für die Quantifizierung durch zytometrische Durchflussanalyse vorzubereiten, fügen Sie 840 Mikroliter S-Basel-Lösung und 60 Mikroliter gereinigter extrazellulärer Vesikel in ein Mikrozentrifugenrohr ein. Fügen Sie 300 Mikroliter der Probe in zwei zusätzliche Mikrozentrifugenröhrchen zusammen mit sieben Mikrolitern einer geeigneten potentiometrischen Sonde pro Röhre hinzu. Fügen Sie sieben Mikroliter von 1%Triton X-100 in die letzte Röhre und mischen Sie alle Rohre durch Wirbeln.
Legen Sie eine Beschallungsspitze in die Mitte des Rohres der dritten Probe und pulsieren Sie die Probe 10 Mal mit 20 % Leistung und einem 30%-Zollzyklus. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter S-Basel-Lösung zu zwei Kontrollmikrozentrifugenröhren hinzu und fügen Sieben Mikroliter Sonde in das reine Farbstoffrröhre ein. Beschriften Sie nur das zweite Rohr Buffer.
Dann inkubieren Sie alle Rohre für eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt vor ihrer Analyse durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Dateien in der entsprechenden zytometrischen Flussanalysesoftware. Legen Sie ein rechteckiges Tor, das am oberen Rand des Grundstücks beginnt, das sich von der kleinen Winkellichtstreuebene einmal 10 bis zu zwei mal 10 bis zu den Vieren erstreckt, und bringen Sie das Tor nach unten, bis es etwa 2,5 % der gesamten Ereignisse enthält.
Benennen Sie das Tor nach der Sonde, kopieren Sie das Gate, und fügen Sie es in die beiden anderen Beispiel- und Steuerdatendiagramme ein. Exportieren Sie dann die Analyse in eine Kalkulationstabelle. Hier werden repräsentative Ergebnisse aus 10 biologischen Repliken gezeigt.
Die Variabilität zwischen den Replikationen ist nicht signifikant und der typische Standardfehler des Mittelwerts der Populationsgröße beträgt etwas mehr als 10%Die Übertragung von Tieren zwischen Platten führt zu einem Verlust von etwa 10%, während etwa 20% der Tiere in der Saccharose-Flotationsstufe verloren gehen. Im Durchschnitt werden 1 000 wildlebende junge erwachsene Tiere ein Mikrogramm Proteine mit mehr als 10 Kilodaltonen in ihre Umwelt absondern. Wenn dieser Anteil weiter durch größenausschlusschromatographie getrennt wird, zeigt das gesamte Protein-Elutionsprofil einen kleinen Proteinspitzen zwischen zwei und sechs Millilitern und einen großen Peak nach acht Millilitern.
Die extrazellulären Vesikel sind innerhalb der ersten fünf Milliliter der Säule eluate enthalten. In einem direkten Vergleich der Strömungszytometrie-Eigenschaften zwischen C.elegans und menschlichen extrazellulären Vesikeln zeigt ein Histogramm von C.elegans extrazellulären Vesikelprobenereignissen, sortiert nach kleinwinkellicher Lichtstreuung, dass alle Präparate mit einer mittleren Fluoreszenzintensität von etwa einem mal 10 bis dritten Gipfel erreichen. Die potentiometrische Sonde DI-8-ANEPPS, die C.elegans extrazelluläre Vesikel robust beschriftet, und die Fülle von gereinigten extrazellulären Vesikeln, sortiert nach dem DI-8-ANEPPS-Ausdruck, unterscheidet sich nicht signifikant zwischen C.elegans und zellkulturabgeleiteten Präparaten.
Die mit diesem Verfahren erstellten Proben sind für alle typischen nachgeschalteten extrazellulären Vesikelanalysemethoden geeignet, einschließlich RNA-SEQ, Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse und proteomischer Analyse. Die Festlegung von Methoden zur Reinigung von C.elegans extrazellulären Vesikeln ermöglicht es Forschern, dieses einfache Wirbellose Modell zu verwenden, um die genetischen Bahnen und physiologischen Prozesse zu untersuchen, die sich auf die zusammensetzung der extrazellulären Vesikelladung auswirken.
