Dieses Protokoll ermöglicht es, eine gute Isolierung von extrazellulären Vesikeln und die Meldung einer höheren Anzahl von EBDF-Proteinen zu gewährleisten. Im Vergleich zu anderen Isolationstechniken behauptet diese, dass es mehr Integrität und vertikale Aktivitäten ist. Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr unter LC und pathologischen Bedingungen untersucht.
Diese Methode kann auf alle Systeme angewendet werden, die wir wählen, um die Elektrofahrzeuge zu charakterisieren und zu studieren. Für diesen Inhalt oder die biologische Ethik ist bei der Iterierung von Elektrofahrzeugen besondere Aufmerksamkeit geboten, wie in der Kultur zu den folgenden Experimenten führt. Eine visuelle Demonstration ist entscheidend für die Aufnahme spezifischer Geräte wie eine hausgemachte Farbtonographiekolonne für Größenausschluss sowie die Einbeziehung von Nanopartikelzählern und Massenspektrometern.
Als Beweis für das Verfahren wird Antonella Raffo-Romero aus dem Labor beitragen. Beginnen Sie mit der Vorisolierung extrazellulärer Vesikel oder Elektrofahrzeuge aus dem Zustandsmedium. Übertragen Sie den Zustand auf Kulturmedium von Mikroglia- oder Makrophagenkulturen in ein konisches Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 1, 200 mal G für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet.
Übertragen Sie den Überstand für weitere 20 Minuten in ein neues konisches Rohr und eine neue Zentrifuge, um apoptotische Körper zu eliminieren. Dann den Überstand in ein 10,4 Milliliter Polycarbonat-Rohr geben. Legen Sie das Rohr in einen 70,1 TI Rotor und Ultrazentrifuge bei 100. 000 mal G für 90 Minuten bei vier Grad Celsius, um die EVs zu pellet.
Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 200 Mikrolitern 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS wieder aufsetzen. Um die Elektrofahrzeuge zu isolieren, bereiten Sie eine hausgemachte Spalte mit Ausschlusschromatographie vor, indem Sie eine Glaschromatographiesäule waschen und sterilisieren und einen 60-Mikroliter-Filter an der Unterseite platzieren. Stapeln Sie die Säule mit vernetzter Agarose-Gel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 Zentimetern und einer Höhe von 20 Zentimetern zu schaffen.
Dann spülen Sie die Phase mit 50 Milliliter0,2 Mikrometer gefilterten PBS. Bewahren Sie die Säule bei Bedarf bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung auf. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase und sammeln Sie 20 sequentielle Fraktionen von 250 Mikrolitern, während Sie weiterhin PBS an der Spitze der stationären Phase hinzufügen.
Die Fraktionen können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um eine Nanopartikel-Tracking-Analyse durchzuführen, machen Sie eine Verdünnung jeder Fraktion mit 0,2 Mikrometer gefilterten PBS und Wirbel es, um Aggregate zu beseitigen. Legen Sie die Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze und legen Sie sie in die automatische Spritzenpumpe.
Passen Sie als Nächstes die Kameraeinstellungen an die entsprechende Bildschirmverstärkungsstufe und Kameraebene an und klicken Sie auf Ausführen. Laden Sie die Probe 15 Sekunden lang in die Analysekammer mit einer Infusionsrate von 1000. Verringern und stabilisieren Sie dann den Geschwindigkeitsfluss für Videoaufnahmen auf eine Infusionsrate von 25 für 15 Sekunden.
Erfassen Sie drei aufeinander folgende 60-Sekunden-Videos des Partikelflusses. Passen Sie dann den Kamerapegel und den Erkennungsschwellenwert vor der Videoanalyse an. Klicken Sie auf Einstellungen OK, um die Analyse zu starten, und klicken Sie auf Exportieren, wenn Sie fertig sind.
Waschen Sie das System mit einem Milliliter 0,2 Mikrometer gefilterten PBS zwischen jeder Fraktion. Wenn Sie eine Elektronenmikroskopieanalyse durchführen, verwenden Sie einen 50 Kilodalton-Zentrifugalfilter, um die Größenausschlusschromatographie-Fraktionen von Interesse zu konzentrieren. Für die Proteinextraktion 50 Mikroliter RIPA-Puffer mit der EV-Probe fünf Minuten auf Eis mischen.
Sonicate die Proben dreimal mit 500 Watt und 20 Kilohertz für fünf Sekunden. Dann entfernen Sie vesikuläre Trümmer durch Zentrifugieren bei 20.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Isolierung der Proteine führen Sie die Proteinmigration im Stapelgel eines 12%polyacrylen Gels durch.
Mischen Sie die Proteine im Gel mit Coomassie Blue für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dann verbrauchen Sie jedes farbige Gelstück und schneiden Sie es in kleine Stücke. Legen Sie die Gelstücke durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden Waschungen, wie im Manuskript beschrieben.
Dann trocknen Sie sie vollständig mit einem Vakuumkonzentrator. Nach dem Trocknen führen Sie Proteinreduktion mit 100 Mikroliter 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat mit 10 Millimolar Dithiothreitol für eine Stunde bei 56 Grad Celsius. Als nächstes führen Sie Proteinalkylierung mit 100 Mikrolitern von 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat mit 50 Millimolar Iodoacetamid für 45 Minuten im Dunkeln.
Waschen Sie die Gelstücke nach Manuskriptanweisungen und trocknen Sie sie vollständig auf dem Vakuumkonzentrator. Führen Sie die Proteinverdauung mit 50 Mikroliter Trypsin in 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat bei 37 Grad Celsius über Nacht durch. Am nächsten Tag die verdauten Proteine mit 50 Mikrolitern 100%ACN für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren aus dem Gel extrahieren.
Dann extrahieren Sie die Proteine zweimal mit 50 Mikroliter 5%TFA in 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat, während kontinuierlich für 20 Minuten rühren. 100 Mikroliter ACN hinzufügen und 10 Minuten weiterrühren. Anschließend die Proteine trocknen und in 20 Mikrolitern 0,1%TFA wieder aussetzen.
Die Probe mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze mit C 18-Reverse-Phasen-Medien zur Entsalzung und Konzentration von Peptiden entsalzen. Dann elute sie mit ACN und 0,1%Ameisensäure. Trocknen Sie die Probe vollständig mit einem Vakuumkonzentrator und setzen Sie sie in 20 Mikroliter ACN und 0,1% Ameisensäure für flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie oder LC-MS wieder auf.
Laden Sie die verdauten Peptide in das Gerät und führen Sie eine Probenanalyse durch. Um die EV-Isolation zu bestätigen, wurde jede SCC-Fraktion einer Nanopartikel-Tracking-Analyse unterzogen. Die Partikelzahl war in den Fraktionen fünf, sechs und sieben deutlich höher.
Diese Fraktionen wurden in einer Stichprobe 2F-EV positiv gepoolt, und verglichen mit EV-negativen Fraktionen, 1F-EV negativ und 3F-EV negativ, mit Western Blot-Analyse. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Hitzeschockprotein 90 in der EV-positiven Probe und in der Zelllysatkontrolle. Die Elektronenmikroskopie der EV-positiven Probe zeigte Elektrofahrzeuge im Größenbereich von etwa 100 Nanometern und 400 Nanometern.
Die Proteomik-Analyse wurde durchgeführt, um Kontaminantenproteine in EV-negativen Proben zu identifizieren und den Proteingehalt von Elektrofahrzeugen zu charakterisieren. Die identifizierten Proteine wurden zwischen 1F-EV-Negativ- und einer 2F-EV-positiven Probe sowie zwischen 2F-EV-positiven und einer 3F-EV-negativen Probe verglichen. Mit dieser nicht zielgerichteten Methode wurde ein Pool von 536 Proteinen in die ExoCarta-Datenbank eingebracht und führte zur Identifizierung von 86 EV-assoziierten Proteinen.
Darüber hinaus ermöglichte dieser Pool auch die Identifizierung von Protein-Wechselwirkungen und derdamit verbundenen biologischen Funktionen. Es wurde festgestellt, dass die Proteine aus der EV-positiven Probe eine Rolle in immun- und neuroprotektive Bahnen spielten. Die Auswirkungen von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen wurden auf das Neuritenwachstum mit PC 12-Zellen und Ratten-Primärneuronen untersucht.
Bei Elektrofahrzeugen wurde ein signifikanter Anstieg des Auswuchses im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Makrophagen-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auf Gliom-Zell-Invasion untersucht. Es wurde festgestellt, dass Elektrofahrzeuge das Wachstum und die Invasion von Gliomsphäriden beeinträchtigten.
Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, den Überstand des Ultrazentrifugationsschritts wirklich sorgfältig zu verwerfen, um den Verlust von Elektrofahrzeugen in diesem Verfahren zu verhindern. Wir bevorzugen einen groß angelegten und nicht zielgerichteten Ansatz, um uns auf den gesamten Proteingehalt und dann auf die vertikale Wirkung von Elektrofahrzeugen zu konzentrieren. so können Inhalte in Nukleinsäuren mittels Analyse zugeordnet werden.
Mit diesem Ansatz aus einer Primärkultur sind wir in der Lage, zwischen EV-Proteinen und freien Proteinen zu unterscheiden, die außerhalb der Vielfalt liegen. Es bleibt also die Frage, ob diese Gerinnung artefaktikuliert ist oder eher
