Dieses Protokoll ist wichtig, da es eine Möglichkeit bietet, extrazelluläre Vesikel aus einer Vielzahl von Bakterien auf hochreproduzierbare Weise zu isolieren. Das Tolle an dieser Technik ist, dass sie verwendet werden kann, um EVs aus ziemlich großen Umgebungen von Bakterienkulturen zu isolieren, was In-vivo-Studien ermöglicht. Während die Daten, die wir zeigen, präklinische Anwendungen widerspiegeln, ist es absehbar, dass dieses Protokoll an die Herstellung bakterieller EVs für Therapeutika angepasst werden könnte.
Diese Methode kann mit geringfügigen Modifikationen auf jedes skalierbare Zellkultursystem angewendet werden. Aufgrund der Skalierbarkeit des Protokolls ist es wichtig, Filter und SEC-Spalten in geeigneter Größe zu haben, um die gewünschten Startvolumina der bakteriellen Zellkultur zu bewältigen. Die Verfahren demonstrieren Sadie Johnson, eine stellvertretende Technologin im Labor von Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, ein Onkologie-Stipendiat im Labor von Dr. Justin Lathia, und Akeem Santos, ein Forschungstechnologe in meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Impfung einzelner Kolonien von Escherichia coli in 250 bis 1000 Milliliter Luria-Bertani oder LB-Brühe mit einer sterilen Schleife. Dann inkubieren Sie die Kultur aerob in einem Schüttelinkubator bei 300 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden Inkubation klären Sie das Bakterienkulturmedium, indem Sie die Zellkulturen in saubere 500-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenflaschen überführen, um sie 15 Minuten lang in einem großvolumigen Rotor mit festem Winkel bei vier Grad Celsius und 5.000 mal G zu zentrifugieren.
Den Überstand in saubere Zentrifugenflaschen überführen, indem Sie ihn 15 Minuten lang vorsichtig bei 10.000 mal G zentrifugieren. Als nächstes wird der Überstand in eine 0,2-μm-Polyethersulfon-Vakuumfiltervorrichtung geeigneter Größe überführt und die Filtervorrichtung an eine Vakuumwandversorgung angeschlossen. Wenn die Filtrationsrate deutlich sinkt, bewegen Sie das ungefilterte Material in ein neues Gerät.
Das gefilterte Medium kann über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Um die vollständige Entfernung der lebensfähigen Zellen zu überprüfen, verteilen Sie ein Aliquot des gefilterten Überstands auf geeigneten Agarplatten und stellen Sie sicher, dass nach der Inkubation unter optimalen Bedingungen für den Bakterienstamm keine Kolonien vorhanden sind. Zum Aufkonzentrieren des gefilterten Mediums mit einem Volumen von 100 Milliliter werden 90 Milliliter gefiltertes Kulturmedium auf das Reservoir der Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 100-Kilodaltonnen-Molekulargewichtsabschaltung geladen und das Medium im schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15- bis 30-Minuten-Intervalle zentrifugiert, bis das Volumen des im oberen Reservoir befindlichen Reservoirs auf weniger als 0,5 Milliliter konzentriert ist.
Um das Reservoir mit dem verbleibenden gefilterten Kulturmedium aufzufüllen, entfernen Sie den Durchfluss in der Unterseite des Geräts, um das Gleichgewicht wiederherzustellen. Wenn die Viskosität des konzentrierten Mediums im Reservoir sichtbar erhöht ist, verdünnen Sie das Medium mit PBS und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation erneut, um nicht-extrazelluläre Vesikel oder EV-Proteine zu reduzieren, die kleiner als der Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton sind. Dann das konzentrierte Medium in ein proteinarmes Binderohr überführen, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern Um das gefilterte Medium mit einem Volumen von mehr als 100 Milliliter zu konzentrieren, wählen Sie eine entsprechend große tangentiale Durchflussfiltration oder TFF-Vorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton.
Nach dem Zusammenbau eines Filtrationskreislaufs, wie im Manuskript erläutert, pumpen Sie 200 Milliliter PBS in ein graduiertes Gefäß, um die geeignete Geschwindigkeit entsprechend der gewünschten Durchflussrate zu bestimmen. Wenn die Geschwindigkeit eingestellt ist, zirkulieren Sie das gefilterte konditionierte Medium mit etwa 200 Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur und sammeln Sie die Moleküle, die kleiner als 100 Kilodalton sind, wobei die Ultrafiltrationsmembran als Abfall in einem separaten Gefäß durchquert wird, bis das Volumen des konditionierten Mediums auf 100 bis 200 Milliliter reduziert wurde. Verdünnen Sie das gefilterte Volumen nacheinander um das Zweifache mit PBS und zirkulieren Sie das Medium mit der Pumpe in kleineren Gefäßen, um das Volumen auf 75 bis 100 Milliliter und dann auf 25 Milliliter und 10 Milliliter zu konzentrieren.
Heben Sie den Zufuhrschlauch aus dem Probenbehälter und pumpen Sie, um den Filter zu reinigen, um die maximale Menge der Probe zu gewinnen. Die konzentrierte Probe wird in eine 15-Milliliter-Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton gebracht und in einem schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15 bis 30 Minuten zentrifugiert, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir weniger als zwei Milliliter beträgt. Das konzentrierte Medium wird in ein proteinarmes Binderohr überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern.
Führen Sie zur Isolierung der EVs eine Größenausschlusschromatographie (SEC) durch, wobei eine kleine Säule mit einem 10-Milliliter-Bettvolumen für weniger als 100 Milliliter Ausgangsmaterial und eine größere Säule mit einem 47-Milliliter-Bettvolumen für mehr als 100 Milliliter Ausgangsmaterial verwendet wird. Einige Stunden vor dem Experiment bringen Sie die SEC-Säule und PBS auf Raumtemperatur und stabilisieren Sie die Säule anschließend in vertikaler Position mit einem Standard-Laborständer und -halter. Bevor Sie es an die SEC-Säule anschließen, hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie fünf Milliliter PBS durch die Fritte in einen Abfallbehälter fließen lassen.
Schrauben Sie dann die Einlasskappe der Säule ab, um dem Probenreservoir zwei Milliliter PBS hinzuzufügen, und verbinden Sie das Reservoir vorsichtig mit der Säule, während das PBS durch die Fritte tropft. Für die Äquilibrierung der Säule fügen Sie 47 Milliliter PBS in das Probenreservoir hinzu, gefolgt von der Entdeckelung der Unterseite der SEC-Spalte. Lassen Sie dann den gesamten geladenen Probenpuffer durch die Spalte fließen und verwerfen Sie den Durchfluss.
Nachdem Sie zwei Milliliter der Probe auf das Probenreservoir geladen haben, lassen Sie die Probe vollständig in die Säule eindringen und sammeln Sie den Durchfluss. Sofort PBS in das Probenreservoir mit einem Volumen von 14,25 Milliliter abzüglich des Probenvolumens geben, damit die Lösung durch die Säule fließen kann, während die Menge verworfen wird, die dem Volumen des Säulenhohlraums entspricht. Als nächstes positionieren Sie ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen mit niedriger Bindung direkt unter der SEC-Säule, um den ersten Durchfluss oder die erste Fraktion zu sammeln, nachdem zwei Milliliter PBS durch die Säule laufen können.
Fügen Sie dem Probenreservoir weiterhin zwei Milliliter PBS hinzu, um jede nachfolgende Fraktion zu sammeln. Lagern Sie die gesammelten Fraktionen bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Für die Sterilitätsprüfung der gesammelten EV-Fraktionen werden drei Milliliter des Kulturmediums mit 100 Mikrolitern der in Assays zu verwendenden Fraktionen beimpft.
Dann kultivieren Sie das Medium unter optimalen Bedingungen unter Beobachtung der Trübung für mindestens drei Tage. Alternativ können die Fraktionsproben auf Agarplatten aufgetragen werden, die das Medium enthalten, das zum Züchten der produzierenden Bakterien verwendet wird, und dann auf Koloniebildung prüfen. Als nächstes lagern Sie die EVs, indem Sie 25 bis 50% der einzelnen oder gepoolten Fraktionen bei minus 80 Grad Celsius in proteinarme Binderöhrchen übertragen, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
Die repräsentative Analyse zeigt die Elution von Escherichia coli MP1 EVs in den frühen Chromatographiefraktionen. Die Fraktionen eins bis sechs enthielten die meisten EVs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 100 Nanometern. Gleichzeitig enthielten die nachfolgenden Fraktionen EV-freie Proteine und sehr wenige EVs.
Die EV-Anreicherung und -Größe wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt, insbesondere in den Fraktionen zwei bis sechs. Es wurde beobachtet, dass EV-angereicherte Fraktionen zwei bis sieben eine hohe Nanoluciferase-Aktivität aufwiesen, aber nur ein sehr niedriges Fluoreszenzsignal von nicht-EV-assoziiertem mCherry im Vergleich zu dem der späteren Fraktionen. Die Immunogold-Markierung bestätigte die EV-Assoziation von Nanoluciferase in Fraktionen zwei bis fünf.
Die Anwendbarkeit des Protokolls auf die anderen Bakterienarten wurde bewertet, indem EVs aus den Kulturen verschiedener anaerober Bakterien isoliert wurden. Es wurde beobachtet, dass die frühen Chromatographie-Fraktionen eins bis vier für EVs mit einer Durchmessergröße von weniger als 100 Nanometern angereichert waren. Die komplexe Hirn-Herz-Infusion (BHI) enthielt die EV-großen Partikel bei weniger als 25% der gesamten EV-Ausbeute.
Es ist wichtig, TFF-Geräte zu verwenden, die in der Lage sind, das Startvolumen der bakteriellen Zellkultur zu handhaben. Diese Technik ermöglicht es uns, genügend EVs zu erzeugen, um biologische Fragen zu ihrer Funktion in komplexen Tiermodellen zu stellen.
