Unser Protokoll bietet einen klaren Prozess zur Untersuchung der neuroverhaltensbedingten Wirkungen der Substanzen und schadstoffe, die für Zebrafischlarven von Interesse sind, und zur Aufdeckung der potenziellen Neurotoxizität dieser Wirkstoffe. Die Technik kann mit Hochdurchsatztests von Neurobehavioren im Zebrafischmodell durchgeführt werden. Diese Methode kann angewendet werden, um allele-neurobehaviorale Auswirkungen von Schadstoffen zu bewerten, um eine potenzielle Neurotoxizität auf uns Menschen zu demonstrieren, da zebrafischgenom eine hohe Homologie mit Menschen hat, so dass es Hinweise für das chemische Management und die durch Schadstoffe verursachten Probleme der öffentlichen Gesundheit liefern kann.
Da Zebrafische den Vorteil eines Hochdurchsatz-Screenings haben, bietet diese Methode Einblick in die Entwicklung von Psychopharmaka und umwelttoxikologische Forschung. Lassen Sie sich nicht einschüchtern, wenn Sie das erste Experiment studieren. Wenn Sie das Protokoll befolgen, haben Sie ein erfolgreiches Ergebnis.
Mindestens zwei Stunden vor der Durchführung eines Experiments stellen Sie die Raumtemperatur auf 28 Grad Celsius ein und fügen Sie jedem Bohrgut einer 48-Well-Mikroplatte 800 Mikroliter Belichtungslösung hinzu. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette mit einer modifizierten Spitze, um eine Larve in 200 Mikroliter Expositionslösung an jeden Brunnen der Mikroplatte zu übertragen, um ein Fortbewegungs- und Pfadwinkelexperiment vorzubereiten. Um eine Sechs-Well-Mikroplatte für Soziale Verhaltensexperimente vorzubereiten, fügen Sie vier Milliliter Expositionslösung zu jedem Brunnen der sechs Well-Mikroplatten hinzu und übertragen Sie zwei Larven in 200 Mikroliter Expositionslösung auf jeden Brunnen.
Bevor Sie mit dem Test beginnen, öffnen Sie das Softwareprogramm für die Überwachung mit hohem Durchsatz und wählen Sie das Modul für die Verfolgungsdrehungen aus. Übertragen Sie die 48-Well-Mikroplatte auf die Aufnahmeplattform und ziehen Sie die Abdeckung nach unten. Klicken Sie auf Datei und Protokoll generieren, um mit dem Generieren eines neuen Protokolls zu beginnen und 48 in die Position "Standortanzahl" einzugeben.
Klicken Sie auf Parameter, Protokollparameter und Zeit, legen Sie die Experimentdauer auf eine Stunde und 10 Minuten und den Integrationszeitraum auf 60 Sekunden fest. Zeichnen Sie mit dem elliptischen Formwerkzeug einen Kreis um die linke Obere Seite. Wählen Sie den Kreis aus, und klicken Sie auf Kopieren, Rechte rechte Markierung, Einfügen und Auswählen.
Verwenden Sie die Maus, um den kopierten Kreis nach oben rechts gut zu ziehen, und klicken Sie auf Kopieren, Oben rechts markieren, einfügen und erneut auswählen. Ziehen Sie dann den kopierten Kreis nach unten rechts und klicken Sie auf Markierungen erstellen und löschen. Das System zieht automatisch einen Kreis über jeden anderen Brunnen der Platte.
Klicken Sie als Nächstes auf Skalierung zeichnen, und zeichnen Sie eine Kalibrierungslinie auf dem Bildschirm. Geben Sie die Länge der Zeile ein, legen Sie die Einheit fest, und klicken Sie auf Gruppe anwenden. Stellen Sie die Tierfarbe auf Schwarz und die Erkennungsschwelle auf 16 bis 18 fest, um die Erkennung der Tiere zu ermöglichen, setzen Sie die inaktive auf eine kleine Geschwindigkeit auf 0,5 Zentimeter pro Sekunde und die kleine auf große Geschwindigkeit auf 2,5 Zentimeter pro Sekunde.
Legen Sie die Pfadwinkelklassen wie angegeben von minus 180 auf plus 180 fest. Um die Lichtverhältnisse einzustellen, klicken Sie auf Parameter, Lichtfahren, Verwendet eine der 3 unten aufgeführten Auslösemethoden und verbesserte Reize, um die Lichtverhältnisse festzulegen. Klicken Sie auf Kante und legen Sie einen dunklen Zeitraum von 10 Minuten fest, gefolgt von drei Zyklen abwechselnder 10-minuten-Licht- und Dunkelperioden.
Speichern Sie dann das Protokoll. Wenn alle Parameter eingestellt sind, schalten Sie die Beleuchtung im Testraum herunter und lassen Sie die Larven 10 Minuten lang im System akklimatisieren. Klicken Sie am Ende des Beschleunigungszeitraums auf Experimentieren und Ausführen, und erstellen Sie den Ordner, in dem die experimentellen Dateien gespeichert werden sollen.
Geben Sie dann den Ergebnisnamen ein, und klicken Sie auf Hintergrund und Start. Klicken Sie am Ende des Experiments auf Experimentieren und Beenden. Dann geben Sie die 48-Well-Mikroplatte für nachfolgende Experimente zurück zum Licht-Inkubator.
Da jede Gruppe 16 Tiere umfassen kann, kann das System verwendet werden, um Tests mit hohem Durchsatz der Fortbewegung und des Pfadwinkels unter verschiedenen Behandlungsbedingungen in einer einzigen 48-Well-Mikroplatte durchzuführen. Die soziale Aktivität der Larven kann mit Sechs-Brunnen-Platten getestet werden. In diesem repräsentativen Experiment zeigte die höchste Konzentrationsgruppe von BDE-47 während der dunklen Periode eine ausgeprägte Hypoaktivität, während während der Lichtperioden keine Veränderungen aufgrund der BDE-47-Exposition beobachtet wurden.
Darüber hinaus führte die hochkonzentrierte Gruppe von 6-Hydroxy-BDE-47 weniger Routine und durchschnittliche Drehungen an fünf Tagen nach der Befruchtung durch. In den 6-Methoxy-BDE47-Expositionsgruppen wurden jedoch reaktionsschnellere Wendungen induziert. Die soziale Aktivität des Zebrafisches wurde durch chloriertes Paraffin-70 und das kurzkettige chlorierte Paraffin-52b stimuliert, während der langkettige chlorierte Paraffin-52a die Dauer des Kontakts der Larven verkürzte.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die übertragenen Larven für den Test eine normale Schwimmfähigkeit und keine Fehlbildungen haben sollten. Andere Variablen, wie Farbpräferenz, Hell-Dunkel-Präferenz, alle Dunkelheit, Schwanzbewegungen von Zebrafischen, können aufgenommen werden, um zusätzliche Fragen über neurobehaviorale Toxizität von Umweltschadstoffen zu beantworten. Die BDE-47 Expositionslösungen sind neurotoxisch und haben ein endokrines Störungspotenzial, also achten Sie darauf, direkten Kontakt mit der Haut zu vermeiden.
