Wir danken Sean Pelkowski für die Unterstützung bei Optimierung des Verhaltens Assay. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 und dem National Institute of Environmental Health Sciences, F32 und R03 ES021342 ES017755 unterstützt.

1. Sammlung von Zebrafisch Embryonen und Larven Raising <ol><li> Glass Pyrex Gerichte mit &quot;fake&quot; Gras (aus grünem Garn) (Abbildung 1) sollte in die Tanks in der Dämmerung eingesetzt und links in zwei Stunden, um Zebrafischembryonen sammeln. Die Glasschalen mit den Embryonen sollte über einen Handheld-Sieb gegossen und mit entionisiertem Wasser gespült. Die Embryos sollen dann in Ei Wasser angebaut werden. Das Ei Wasser enthält 60 mg / l Instant Ocean in entionisiertem Wasser und 0,25 mg / l Methylenblau, die als Form-Inhibitor verwendet wird. </li><li> Abhängig von der Hypothese der einzelnen Experiment können Embryonen sofort oder während bestimmter Phasen der Entwicklung mit Giftstoffen oder Pharmazeutika behandelt werden. Die Giftstoffe und Arzneimittel sind in der Regel in DMSO gelöst (bei 1.000 X-Konzentration) und sollte weiter verdünnt werden direkt in das Ei Wasser Medium. </li><li> Während der Embryonalentwicklung und Larven Behandlung mit Arzneimitteln oder Giftstoffs, können die Larven und Embryonen in Petrischalen tief bei einer Dichte von etwa 50-60 Larven pro 50 ml werden bis zu den Verhaltens-Analysen bei 7 dpf (Ei-Wasser-Lösung sollte geändert werden mindestens jeden zweiten Tag zu Pilz / Bakterienwachstum zu vermeiden untergebracht von toten Embryonen). </li></ol> 2. Vorbereiten Formen für Behavioral Analysen <ol><li> Speziell entwickelte Kunststoff-Formen, die 11.7 cm x 7.6 cm messen x 5 mm wurden in-house individuell gebaut. Die Formen werden benötigt, um die Bahnen unter Verwendung von Agarose in einzelne gut Kunststoffplatten von Thermo Scientific gegossen wird, zu erstellen. Die Single-Well-Platten Maßnahme 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm. </li><li> Die Formen enthalten fünf Spuren in dessen Seiten bei 60 ° abgewinkelt sind. Die Spuren in den Formen sind 3,5 mm hoch, mit einer Grundfläche von 18 mm an der Spitze, die die breiteste ist, während die untere Breite beträgt 14 mm. Es ist ein Abstand von 4 mm zwischen den Spuren in der Form (Abbildung 2). </li><li> Zur Herstellung der Bahnen gießen 50 ml geschmolzener Agarose (0,8% Agarose in deionized Wasser mit 60 mg / L Instant Ocean) in einem einzigen Well-Platte. Die Form sollte dann langsam auf das flüssige Agarose auf Blasenbildung beseitigen platziert und entfernt werden können, wenn der Agarose gekühlt werden (das dauert etwa 45 min). </li><li> Die Agarose Gassen sollte frühestens einen Tag vor der Verhaltens-Experiment laufen soll (um die Agarose Austrocknen zu vermeiden) Die Bahnen können bei Raumtemperatur mit den Deckeln auf die Gerichte werden für gespeicherte bis zu etwa 36 Stunden werden. Die Agarose Gassen sind nur für einen Versuch verwendet werden und sollte dann entsorgt werden. </li></ol> 3. Bilderfassung <ol><li> Bis zu 20 Larven können in jeder Spur der Platten platziert werden. Typischerweise 5 Larven pro Spur verwendet werden, um die genaue Verfolgung der Schwimmgeschwindigkeit zu erleichtern und die Anzahl der Larven, die pro Versuch benötigt werden, zu reduzieren. Die Bahnen können mit Ei Wasser mit oder ohne Arzneimittel oder Giftstoffe in Abhängigkeit von dem Experiment gefüllt werden. Allerdings sollten Spuren nicht fden ganzen Weg, bis sie in den bildgebenden Schränken platziert illed, dies wird ein Überlaufen zu verhindern. Aus Gründen der Einheitlichkeit sollte die Larven haben eine Eingewöhnungszeit von zehn Minuten, nachdem sie in den Agarose Formen platziert und positioniert auf dem Laptop-Bildschirm. Effizient Bewegen der Larven aus der Petrischale zur Agarose Spur wird dazu beitragen, Larven Stress zu reduzieren. Dies ist am einfachsten, wenn die Larven in flachen Behältern oder Petrischalen untergebracht sind. </li><li> Die Imaging-Schränke gehören eine Canon Digitalkamera für Zeitraffer-Fotografie und einem Laptop verwendet. Die Kamera sollte an der Oberseite des Gehäuses platziert werden und zielte in Richtung der Unterseite des Gehäuses, wo ein 15,6-Zoll-Bildschirm mit Laptop-Bildschirm nach oben (Abbildung 3) platziert werden soll. Vier Platten sollten direkt mit der Hand auf dem Laptop-Bildschirm positioniert werden. Zu dieser Zeit die Bahnen können mit Ei Wasser oder chemische Behandlung aufgefüllt werden, so dass es mit der Spitze der Spur ist (um Schatten an den Rändern des l beseitigenanes in den Bildern). </li><li> Eine PowerPoint-Präsentation als aversiven Reiz für die Larven eingesetzt. In den letzten beweglichen roten Kugeln wurde gezeigt Larven in 6 oder 12 Multiwell-Platten 15,17,18 Zebrafische. Die aktuelle PowerPoint beginnt mit einem leeren weißen Hintergrund für 15 min, 15 min von einer sich bewegenden roten Balken auf der oberen Hälfte der Platte (Abbildung 4). Zur Beseitigung Überhitzung der Larven, ist es am besten, einen Laptop mit einem Bildschirm Temperatur nicht über 28 ° C nicht gehen kaufen Zum Verdampfen der Flüssigkeit innerhalb der Agarose Bahnen zu vermeiden, sollte die maximale Aufnahmezeit auf unter 1 Stunde gehalten werden. </li><li> Die Digitalkamera sollte für Zeitraffer-Fotografie programmiert werden, fotografieren alle 6 sec für eine Gesamtmenge von 300 Bildern pro Experiment. Jedoch kann die Frequenz und Länge eingestellt je nach Experiment und Verhaltensstörungen Quantifizierung werden. In den letzten längeren Aufnahmezeiten beschäftigt waren mit größeren Abständen zwischen den einzelnen Bild. Die Kamerein bei einer niedrigeren Auflösung für die Bildgebung bei Video-Geschwindigkeit (30 Bilder pro Sekunde) eingestellt werden. Während die niedrigere Auflösung begrenzt die Aufnahmen zu einem einzigen Multiwellplatte sind die Videoaufnahmen geeignet für schnelle Bildgebung Schwimmen Ereignisse 15. </li></ol> 4. Bildanalyse <ol><li> Die Bilder sollten mit ImageJ geöffnet werden und mit einem Makro, das speziell in-house geschrieben wurde. Das Makro automatisch spaltet die Farbkanäle so dass die rote Farbe entfernt werden können, subtrahiert den Hintergrund, gilt eine Schwelle und identifiziert die Larven durch Partikelanalytik. Die aktuellste Makro für fünf lane Larven Analyse ist Zebrafish_macro25k. Verwenden Sie die Anweisungen in der Makro-auf die Anzahl der Bilder, Farbe subtrahiert werden, Bild Schwelle etc. eingestellt </li><li> Nach all der Bilder durch die ImageJ Makro ausgeführt werden, eine Datei Ergebnisse angezeigt werden und wird x enthalten, y-Koordinaten der einzelnen Larven für jedes Bild zusammen mit dem Bild-Nummer und der Bahn-Nummer. </li&gt; <li> Die Ergebnisse Datei sollte in einer Excel-Format gespeichert und sortiert werden basierend auf leere Hintergrund vs bewegenden bar Hintergrund und dann die Nummer gut. Eine Excel-Vorlage zu verwenden, dass hat Gleichungen gebaut in die automatisch bestimmt die Platzierung der Larven in den Vertiefungen, Abstand zwischen den Larven, die Geschwindigkeit der Bewegung und Menge der Ruhe werden. Die aktuelle Excel-Vorlage wird in der 25ib Creton Labor erstellt, die auf Wunsch zur Verfügung. Diagramme zeigen verschiedene Behandlungsgruppen sollten in die Excel-Tabelle zusammen mit t-Tests zum Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen und Steuerungen gebaut werden. Weitere statistische Analyse kann unter Verwendung von SPSS werden. </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Während wir die kontinuierliche Verbesserung sind unsere neuen Verhaltens-Test, war es schon immer für den Nachweis von Vermeidungs-und Thigmotaxis Verhalten in Zebrafischlarven 15 nützlich. Viele Studien wurden durchgeführt, um die Ergebnisse des Assays zu optimieren, wie z. B. Farbe des Stimulus, ideale Anzahl von Larven pro Spur, und die Länge der Verhaltens-Assay. Früher haben wir Multi-Well-Platten (mit 6 oder 12 Wells) 15,17,18. Doch vor kurzem haben wir die neue Form, um eine Spur größer Schwimmen Raum für die Larven ermöglicht es uns, eine größere Anzahl von Verhaltens-Maßnahmen in einem einzigen Assay 16 (Abbildung 5) sammeln erstellen erstellt. Weitere Modifikationen umfassen Variationen der PowerPoint dargestellt (verändert Bewegung oder die Länge der Assay) und die Größe der Bahnen verwendet (wir haben auch Formen für mehr engen Gassen). Derzeit ist dies automatisiertes Hochdurchsatz-System einzigartig in seiner Fähigkeit, ein breites Spektrum von Verhaltensweisen in zebr messenafish Larven gleichzeitig wie Geschwindigkeit, Vermeidung, Nähe zu anderen Larven und Thigmotaxis in mehrspurigen Platten. Ergebnisse schnell erhalten werden und eine große Anzahl von Larven zum Zeitpunkt erfasst und analysiert werden. Das System ist sowohl kostengünstig zu bauen und schnell und einfach einzurichten. Eine Einschränkung dieses Systems ist, dass 3-D Bewegungen nicht im Zebrafischlarven beurteilt werden. Automatisierte Systeme, die erwachsenen Zebrafisch verfolgen haben die 3-D-Fähigkeit und kann ein breiteres Spektrum von Verhaltensweisen wie Bewegung nach oben oder unten in der Wassersäule 10,19 identifizieren. Eine weitere Einschränkung ist, dass unsere Imaging-System ist derzeit nicht für das Hochdurchsatz-Analysen auf Video Geschwindigkeit optimiert. Video Geschwindigkeit Bildgebung möglich ist, wenn die Einstellung der Kamera auf eine niedrigere Auflösung 15, aber dies schränkt die Analyse auf einer einzigen Platte. Bei der Verwendung der neu geschaffenen &quot;Spur&quot;-Methode, benötigt mehrere Teile des Tests in einer präzisen Art und Weise ausgeführt werden. Beim Einsetzen der Larven in ter Spuren, ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass das Niveau der Flüssigkeit ist sehr flach bis die Platten auf dem Laptop-Bildschirm positioniert sind. Wenn die Bahnen auch mit Flüssigkeit gefüllt sind, werden die Larven in die Peripherie der Platte entweichen kann. Darüber hinaus beim Einsetzen der Form in der Agarose ist darauf zu achten, um die Form sehr langsam verringern. Wenn die Form zu schnell eingeführt wird, werden Blasen in der Agarose bilden und wird durch die Image-J Makro als zusätzliche Larven identifiziert werden. Es wird darauf hingewiesen, dass, wenn die Agarose Fahrspuren sogar ein paar Blasen haben, ist es am besten, um neue zu machen. In Zukunft möchten wir unsere Verhaltens-Assay zu optimieren, um andere komplexe Verhaltensweisen wie das Lernen in Zebrafisch-Larven zu analysieren und zu prüfen, wie das Lernen durch die Einwirkung von Giften und Arzneimitteln in der frühen Entwicklung beeinträchtigt werden kann. Wir arbeiten derzeit an Tests, die nützlich sein für die Analyse von Lernverhalten in denen die Verhaltens-Ergebnisse erleichtern festzustellen, welche Hirnareale sind, können möglicherweisebeeinflusst durch bestimmte Giftstoffe oder Arzneimittel während der Entwicklung. Automatisierte Tests sind zur Messung von Lernverhalten in Zebrafischlarven 20 und diesen Assays kann für High-Throughput-Screening amendable mit dem robusten Vermeidungsreaktion in multi-lane Platten entwickelt. Wir schlagen vor, dass dieses Verhalten Assay in zukünftigen Studien konnte zum Testen der Wirkungen auf die Entwicklung einer Vielzahl von Pharma-und Giftstoffe eingesetzt werden. Solche Studien würden eine Fülle von Informationen über spezifische Risikofaktoren bieten und dazu beitragen, die Einstellung besser Gesundheits-und Sicherheitsrichtlinien für schwangere Frauen und Kinder.

Zebrafische sind immer ein beliebtes Modell für genetische, Entwicklungs-und Verhaltenswissenschaften 1-4. Sie schlüpfen aus ihren Chorions von 2-3 Tagen nach der Befruchtung (DPF), entwickeln voll funktionsfähige Organe von 4-5 dpf, und weisen eine Vielzahl von Verhaltensweisen, die von 7 dpf 5,6. Zebrafisch-Larven sind ideal geeignet für High-Throughput-Analysen aufgrund ihrer geringen Größe 7,8 geeignet. Software ist im Handel erhältlich für die automatisierte Analyse von Verhalten in Larven und erwachsenen Zebrafisch 9-14. Jedoch kann diese Software teuer und hat begrenzte Möglichkeiten zur Messung komplexes Verhalten von Zebrafisch-Larven in Multiwell-Platten. Wir haben eine neue High-Throughput-Bildgebungssystem, die kostengünstig zu installieren und kann eine Reihe von verschiedenen Verhaltensweisen in 7 dpf Zebrafischlarven 15,16 quantifizieren. Das System ermöglicht es uns, schnell und effizient testen subtile Verhaltensauffälligkeiten nach embryonale Exposition gegenüber einer Reihe vonPharma-und Umweltgifte 16-18. Das System wurde mit Hilfe Holzschränke, die Haus eine digitale Kamera an der Oberseite des Gehäuses. Die Kamera weist nach unten zum Boden des Gehäuses, wo ein Laptop mit dem Bildschirm nach oben 15 angeordnet ist. Zeitraffer-Aufnahme verwendet wird, um die Platzierung der Larven in die Gassen zu erfassen. Larven können in untergebracht werden bis zu vier Multi-Well-oder multi-lane Platten, die oben auf dem Laptop-Bildschirm positioniert werden. Wir verwenden eine PowerPoint-Präsentation als aversiven Reiz auf die sich die Larven durch eine Abkehr (Vermeidung) und schwimmen auf der Kante (Thigmotaxis) 15,17 reagieren. Die Bilder werden in ImageJ importiert, in dem eine automatisierte Makro verwendet wird, um die Farbkanäle aufgeteilt, subtrahieren Sie den Hintergrund, und eine Schwelle zu einzelnen Larven zu identifizieren. Koordinaten werden für jede Larve in jedem Bild aufgeführt und können in eine Excel-Datei, die wir verwenden, um die Vermeidung und thigmota quantifizieren eingefügt werdenxis Verhalten, Fisch zu Fisch Distanz schwimmen Geschwindigkeit und Menge der Ruhe 16.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

Wir haben eine neue High-Throughput-Bildgebungssystem für die Analyse des Verhaltens erstellt in 7 Tage alten Zebrafischlarven in mehrspurigen Platten. Das System misst spontane Verhalten und die Reaktion auf einen unangenehmen Reiz, der zu den Larven als PowerPoint-Präsentation gezeigt. Die aufgenommenen Bilder werden mit einem ImageJ Makro, das automatisch spaltet die Farbkanäle analysiert, subtrahiert den Hintergrund, und eine Schwelle zu einzelnen Larven Platzierung in den Gassen zu identifizieren. Wir können dann importieren Sie die Koordinaten in einer Excel-Tabelle zu schwimmen Geschwindigkeit, Vorliebe für Rand oder an der Seite der Fahrspur, ruht Verhalten, Thigmotaxis, Abstand zwischen den Larven und Vermeidungsverhalten zu quantifizieren. Subtile Veränderungen im Verhalten sind leicht zu erkennen mit unserem System, so dass es nützlich für Verhaltens-Analysen nach der Einwirkung von Umweltgiften oder Arzneimitteln.

In unserer früheren Tests mit dem springenden Ball aversiven Reiz, die unbehandelt sind Wildtyp-Larven reagieren auf die Bewegung Kugel durch Schwimmen in der Mulde (Vermeidungsverhalten) und zu den Rändern des Brunnens (Thigmotaxis Verhalten) 15. Wir haben später bestätigt, dass Thigmotaxis Verhalten in diesem Test ein Maß für Angstverhalten in Zebrafischlarven 17 ist. Es zeigten sich signifikante Unterschiede in den Larven Bewegung weg von der Kugel und Vorlieben für den Rand, wenn die leeren weißen Hintergrund verglichen. Diese Verhaltensweisen sind auch in unserem neuen Test unter Verwendung des beweglichen roten Balken bestätigt worden und sind noch robuster 16. Darüber hinaus können wir jetzt probieren, eine größere Anzahl von Verhaltensweisen in einem einzigen Assay einschließlich schwimmen Geschwindigkeit, Ruhe, Präferenz für das Ende oder der Seite des gut und der Abstand zwischen Fisch (Abbildung 5). Control-Larven im Ei Wasser gewachsen zeigen eine erhöhte Präferenz zu sein, die in der Schale und am Rande der Fahrbahn einerach sie sind mit einem aversiven Reiz (Bewegung roter Balken) dargestellt. Ähnliche Ergebnisse erhält man, wenn Larven im Ei Wasser mit 1 ug / ml DMSO, ein Lösungsmittel, das häufig verwendet wird, um verschiedene Arzneimittel und Giftstoffe wie 1000 X Stammlösungen auflösen angebaut werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5 in Larven mit Ei Wasser und DMSO (als Kontrolle) und verschiedene Konzentrationen eines Organophosphatschädlingsbekämpfungsmittelintoxikation häufig in Nicht-Bio-Lebensmitteln behandelt gezeigt. Die gezeigten Ergebnisse sind ein Sampling von einem Experiment. Wenn jedoch wiederholt, zeigen die Ergebnisse, dass schwimmen Geschwindigkeit und Thigmotaxis Verhalten durch niedrige Konzentrationen von Organophosphatschädlingsbekämpfungsmittel, die Ebenen in der menschlichen Nahrungsaufnahme 18 Mimik verändert wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> Abbildung 1. Auffangwannen. Glass Pyrex Gerichte werden verwendet, um e zu sammelnmbryos von den Erwachsenen Aquarien. Deckel von den Pyrex Gerichte wurden geschnitten und mit Kunststoff-Gitter und grünen Garn wurde auf den Gittern in der Kunststoff genäht. Dies schafft eine Atmosphäre für die Zucht erwachsenen Zebrafisch durch Nachahmung der natürlichen Umwelt. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> Abbildung 2. Kunststoff-Formenbau und Agarose Gassen. A) Die Form wird auf der linken Seite gezeigt. 0,8% Agarose in eine Ein-Well-Platte gegossen, die Form langsam eingeführt und dann entfernt werden, wenn die Agarose abgekühlt B) Die Platte auf der rechten Seite die Gassen in Agarose durch die Kunststoff-Formenbau erstellt zeigt.. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> Abbildung 3. Imaging Schränke. Imaging Schränke waren specially in unserem Labor gebaut und für High-Throughput-Verhaltens-Analysen. Ein 15-Megapixel-Digitalkamera wurde an die Spitze des Kabinetts nach unten, um Zeitraffer-Bilder der Larven in mehrspurigen Platten oben auf dem Bildschirm eines Laptops platziert sammeln angebracht. Zwischen den Platten und dem Bildschirm befindet sich eine Kunststoffabdeckung, die verwendet werden, um Moiré-Muster in den Bildern gesammelt verhindern. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> Abbildung 4. Blank Hintergrund und PowerPoint aversiven Reiz. Dies ist die aktuelle PowerPoint, die verwendet werden, um Verhaltensänderungen in Zebrafischlarven hervorrufen wird. Es bietet robuste Verhaltensunterschiede zwischen a) dem leeren Hintergrund und B) der beweglichen roten Balken. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> Abbildung 5. Verhalten in der High-Throughput-Assay quantifiziert. Beispiel der Verhaltensweisen, die von unseren Verhaltens-Assay in der Excel-Tabelle, die wir für x, y-Koordinaten der Larven quantifiziert werden. Die weißen Balken zeigen Daten aus Larven ausgesetzt auf eine leere Hintergrund und die roten Balken zeigen Daten aus den Larven ausgesetzt, um die rote bewegliche Stange in der PowerPoint. Die Diagramme zeigen die Messungen, die von der Verhaltensanalyse A) erhaltenen Prozentsatz der Larven untergliedert werden können in der Spur, B) Prozentsatz der Larven am Ende der Gasse, C) Prozentsatz der Larven auf dem Rand der Fahrspur, D) Abstand zwischen Fisch (mm), E) Schwimmen Geschwindigkeit der Larven (mm / min), F) Prozentsatz Rest der Larven. In den Diagrammen werden die Daten aus treatment der Larven mit DMSO Kontrolle und verschiedenen Konzentrationen eines Pestizids im Bereich von 0,001 bis 0,1 um (Level allgemein in der menschlichen Ernährung gefunden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Unser Labor eine neuartige automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebungssystem, die nützlich für die Detektion von verschiedenen Verhaltensweisen in 7 Tage alten Larven Zebrafisch ist. Das System kann zum Erfassen geringfügige Änderungen im Verhalten nach der Larven für Umweltgifte oder Arzneimitteln ausgesetzt wurden verwendet werden.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Aufrufe.  Brown University. Unser Labor eine neuartige automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebungssystem, die nützlich für die Detektion von verschiedenen Verhaltensweisen in 7 Tage alten Larven Zebrafisch ist. Das System kann zum Erfassen geringfügige Änderungen im Verhalten nach der Larven für Umweltgifte oder Arzneimitteln ausgesetzt wurden verwendet werden.

Serie: Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Forschung

Neurowissenschaften

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Eine allgemeine Methode zur Bewertung der Inkubation von Saccharose Craving in Ratten

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Die Macht der Interstimulus Intervall für die Beurteilung der zeitlichen Verarbeitung bei Nagern

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...