Der neuartige Tank-Assay wird mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen in Zebrafish kombiniert bietet eine Methode, um zu sezieren, wie das Gehirn Stress moduliert und wie neuronale Schaltkreise disreguliert werden können. Genetische und neuronale Signalwege sind stark zwischen Zebrafischen und Säugetieren konserviert und diese Technik kann dazu beitragen, unser Verständnis der Mechanismen, die der Stressreaktion zugrunde liegen, zu fördern. Die Methode ist nicht spezifisch für Zebrafische und wurde mit den mexikanischen blinden Höhlenfischen verwendet und kann daher potenziell auf andere Fischarten ausgedehnt werden.
Ein Probelauf kann hilfreich sein, um die richtige Ausleuchtung und den Kontrast des Tieres vor einem Hintergrund zu bestimmen, um eine erfolgreiche Verfolgung zu erreichen. Der Test wird selten verwendet, kann aber ein beteiligter Prozess sein. Die Visualisierung der Schritte wird anderen Forschern helfen, das Verfahren erfolgreich auszuführen.
Jacqueline Chin, Post-Doc im Labor, und Lydia Albert, Studentin, werden dieses Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Befüllung eines 250-Milliliter-Bechers und mindestens zweier Haltebecken mit Fischsystemwasser. Übertragen Sie am Morgen des Tests mindestens 10 erwachsene Zebrafische für jede Versuchsbedingung in einzelne Haltebecken, bevor Sie alle Fische für mindestens eine Stunde in den Verhaltensraum überführen.
Beschriften Sie die Tanks so, dass der Zustand oder Genotyp der Tiere für den Experimentator blind ist, und verwenden Sie ein Netz, um einen einzelnen Erwachsenen sanft in das fertig gefüllte Becherglas zu legen. Lassen Sie die erwachsenen Fische 10 Minuten im Becher klauen, bevor sie das Wasser und die Fische aus dem Becher in den experimentellen neuartigen Tank gießen. Sobald sich der Fisch im Becken befindet, beginnen Sie mit der Kameraaufnahme und entfernen Sie sich vom Setup, um zusätzliche Stellleiden für die Fische zu verhindern.
Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, entfernen Sie die Person aus dem neuartigen Tank und legen Sie den Fisch in einen neuen Haltetank. Um die Auswirkungen bestimmter Medikamente von Interesse zu bewerten, verdünnen Sie das Medikament zu einer Arbeitskonzentration in 250 Milliliter Becher systemwasser. Mit einem Becher mit Systemwasser nur als Steuerung.
Maskieren Sie die Identitäten des Medikaments und Kontrollbecher, um sicherzustellen, dass der Tester bis nach der Analyse blind für die Behandlungsbedingungen ist, und führen Sie einen neuartigen Tanktest durch, wie gezeigt, um eine grundlegende Verhaltensstressreaktion zu erhalten. Verwenden Sie am Ende der Basisaufzeichnung ein Netz, um den Fisch sofort für 10 Minuten in einen der Testbecher zu übertragen, bevor Sie den Fisch in ein ausgewaschenes Becherglas überführen, das nur frisches Systemwasser enthält. Es ist wichtig, separate Netze zu verwenden, die für jedes Behandlungsbecherglas bestimmt sind, um eine versehentliche Verdossierung des Kontrollfisches zu verhindern, insbesondere wenn mehrere medikamentöse Behandlungen im Spiel sind.
Legen Sie den Fisch nach 10 Minuten in einen neuen neuartigen Tank für einen zweiten neuartigen Tanktest. Am Ende des Tests übertragen Sie den erwachsenen Zebrafisch in einen neuen Haltebehälter und ersetzen das Systemwasser im zweiten neuartigen Tank durch frisches Systemwasser für den nächsten Schritt, um eine Kreuzkontamination des Versuchsmittels zu verhindern. Am Ende aller Versuche, kehren Sie die Individuen in die Fischanlage zurück.
Hier wird die Bewegungsaktivität eines einzelnen Zebrafisches in der ersten und letzten Minute eines 10-minütigen neuartigen Tanktests gezeigt. Wenn die Fische zum ersten Mal in den Tank eingeführt werden, verbringen sie in der Regel die meiste Zeit im Boden des neuartigen Tanks. Im Laufe der Zeit zeigen die erwachsenen Fische jedoch eine allmähliche Zunahme der Zeit, die in der Spitze des Tanks verbracht wird.
Tatsächlich ist die Gesamtzeit, die in der ersten Minute in der Spitze des Tanks verbracht wird, deutlich kürzer als in der letzten Minute des neuartigen Tanktests. Im Gegensatz dazu zeigt die Gesamtstrecke zwischen der ersten und letzten Minute keine signifikanten Unterschiede. In diesem repräsentativen Experiment ergab die Analyse der erwachsenen Zebrafisch-Lokmotorpfade wenig Unterschied zwischen der Schwimmaktivität von Zebrafischen vor und nach der Behandlung für Gruppen von Erwachsenen, die allein dem Fahrzeug ausgesetzt waren.
Im Gegensatz dazu verbrachten Erwachsene, die einem angstlösenden Medikament ausgesetzt waren, eine große Zeit in der Oberseite des Tanks im Vergleich zu den Bewegungspfaden des gleichen Fisches vor der Exposition des Medikaments. Diese Unterschiede waren nicht auf weniger Fortbewegung im Allgemeinen zurückzuführen, da für eine der Gruppen keine signifikanten Unterschiede in der zurückgelegten Entfernung gemessen wurden. Da Verhaltensrhythmen von zirkadianen Prozessen beeinflusst werden, achten Sie darauf, experimentelle Replikationen durchzuführen, die an verschiedenen Tagen während der gleichen Tageszeit für jedes Experiment durchgeführt werden.
Zusätzliche Verhaltenstests, wie z. B. der Freifeldtest oder andere physiologische Stressmessungen, können durchgeführt werden, um die Ergebnisse des neuartigen Tanktauchtests weiter zu validieren. Diese Methode kann ein hoher Durchsatz Assay für die Behandlung von Fragen im Zusammenhang mit Stress, Angst, und Angst verwendet werden.
