Diese Arbeit wurde von internationalen Marie-Curie Reintegration Stipendium unterstützt.

Ein. Vorrichtung Fabrication <ol><li> Gekaufte DTPA-D SU-8-Steuerung Schimmel und SPR220-7-Flow Form aus dem Stanford Microfluidics Foundry ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / group / Gießerei</a> ). </li><li> Setzen Sie die Silikonformen zum Chlortrimethylsilan (TMCS) Dampf für 10 min bis Elastomer Release Nach dem Backen die Schritte 9 zu fördern. </li><li> Vorbereitung einer Mischung aus Silikon basierenden Elastomer und Härtungsmittel (gut mischen) in zwei verschiedenen Verhältnissen 5:1 und 20:1 für die Kontrolle und Strömung Schimmelpilze sind. Die unterschiedlichen Verhältnisse sind die für eine einwandfreie Verklebung von mehreren Schichten. </li><li> Gießen Sie die 5.01 PDMS über die Kontrolle Schicht (ca. 5 mm Höhe). Degas die Kontrolle Schicht und backen für 30 min bei 80 ° C. Schleuderbeschichten (Laurell, USA) die 20.01 PDMS-Gemisch auf die Strömung Schicht bei 2600 UpM für 60 Sekunden und dann backen bei 80 ° C für 30 min. Die Spin Coater Geschwindigkeit zur Ansteuerung des Ventils bei einem Druck optimiertvon 15 psi. Schneller drehenden wird in einer dünneren Schicht mit niedrigerem Druck und Aktivierung umgekehrt. Die Geräte verwenden wir eine Grenze von 25 psi in der Kontrollgruppe und 10 psi in Strömungsrichtung vor dem Ablösen vom Substrat auftreten können. </li><li> Trennen die Steuerschicht aus der Form. Machen Sie es langsam und vorsichtig sein, nicht schälen SU8 Muster. Dann schneiden die Vorrichtung um seinen Umfang und Stanzlöchern die Steuerkanäle zu übersetzen. </li><li> Richten Sie den Fluss und die Kontrolle Layer manuell unter einem Stereoskop. Beginnen Sie mit dem Ausrichten der oberen linken Ecke, die Schaltfläche Ventil (Control Layer) muss in der Mitte der Reaktionskammer (flow Schicht) sein. Danach richten Sie die erste Zeile und sanft die Steuerung freigeben Schicht Zeile für Zeile. Sicherstellen, dass alle Ventile Taste in der Mitte der Reaktionskammern sind und dass die Adresse und Einlaßventile kreuzen die Strömungskanäle in der korrekten Position. Das Verfahren kann vor Ort wiederholt werden, bis alle Reihen ausgerichtet sind. Am Ende, lassen Sie jede Spannung in der PDMS by heben Sie ihn vorsichtig von den Seiten und Ecken. Heben Sie nicht zu viel oder Versatz auftreten. </li><li> Backen für 2 Stunden bei 80 ° C. </li><li> Cut um den Umfang der Vorrichtung und Schale der beiden Schicht-Vorrichtung (Chip) aus dem Strom Form. Lochen, um die Strömungskanäle (Abbildung 1) zugreifen. </li></ol> 2. DNA Anordnen und Device Alignment <ol><li> Produzieren synthetischer Gene durch Montage PCR. Die synthetischen Gene sind aus T7-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), ORF mit zwei Epitop-Tags (eine an jedem Ende), und T7-Terminator 4 komponieren. Die Gene können in der Länge von 100 bp bis zu variieren, zumindest, 5,000 bp. </li><li> Bereiten Sie die synthetischen Gene zum Anordnen: Ausarbeitung einer Mischung aus Poly Ethylen Glykol (1,25%) und D-Trehalosedihydrat (125 mg / ml) und verzichten 2 ul pro Reaktion in 384 Vertiefungen Platte. Diese Lösung wird irreversible Bindung der DNA an die Glas sowie zur Visualisierung während der Ausrichtung 10 zu reduzieren. </li&gt; <li> Übertragen Sie die synthetischen Gene an die 384 Wells Platte. Normalerweise DNA Konzentrationen von 10 ng / ul bis 100 ng / ul Endkonzentration reichen. Hinzufügen dH 2 O auf ein Endvolumen von 20 ul (abhängig Microarrayer und Pin-Typ). </li><li> Spot eine Reihe von synthetischen Genen auf Epoxy beschichtete Glassubstrate mit einem Microarray. Wir verwenden MicroGrid 610 (Bio Robotics) mit SMT-S75 Silikon-Pins (Parallel Synthesis, USA). Kontaktieren des DNA-Druckverfahren, mit diesen speziellen Stiften, resultiert in Spots mit einem Durchmesser von etwa 100 um auf der Glasoberfläche. Jeder Pin Last reicht für ca. 100 Plätze. Stellen Sie sicher, dass die Spalte und Zeile Stellplätze auf den spezifischen Gerät verwendet entsprechen. Das Gerät, das wir verwenden, enthält 16 Spalten und 40 Reihen mit einem Abstand von 680 um durch 320 &amp;mgr; m. </li><li> Manuelle Ausrichtung des mikrofluidischen Vorrichtung zur Gen-Array unter einem Stereoskop. Die DNA-Spot sollte in der Mitte der Kammern DNA sein. Beginn der Angleichung, indem Sie die erste Zeile von Punkten below die erste Reihe von DNA-Kammern. Dann, in Einklang zu bringen die restlichen Zeilen Schlichten mit Feinabstimmung des gesamten Gerätes. Sobald das Array ausgerichtet ist darauf zu achten, um eine Belastung in der PDMS lindern, durch Anheben lokal werden. Wenn es Spannungen in der PDMS es kann nicht gut auf dem Mikroarray verlassen. </li><li> Schließlich Bindung des Geräts an den Glasobjektträger durch Inkubation über Nacht auf einer Heizplatte bei 80 ° C </li></ol> 3. Grundierung und Gerät aktivieren <ol><li> Die Ventile in der Steuerungsschicht werden vom Computer mittels LabVIEW betätigt. Die LabVIEW-Skript steuert eine Reihe von Magneten Mikroventile über ein elektronisches Steuergerät (erworben von Stanford Microfluidics Foundry). Das Magnetventil Verteiler mit Druckluft, die den Luftstrom und Druck in die Steuerventile an der Vorrichtung steuern. </li><li> Schließen Sie das Gerät an die Magnetventile Verteiler mit einem flexiblen Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,02 &quot;(Tygon) Und Edelstahl-Stift (New England Small Tubes Corporation). </li><li> Füllen Sie die Röhrchen mit DDW und stecken Sie den Stift in die Zugang Löcher der Steuerungsebene. Sicherstellen, dass jedes Rohr an seinen entsprechenden Steuerkanal angeschlossen ist. </li><li> Führen Sie die LabVIEW-Anwendung auf dem Computer, um die Steuerkanäle aktivieren. Durch die Aktivierung des Ventils aus der LabVIEW-Skript, wenden wir Luftdrucks, die wiederum das Wasser in die PDMS-Steuerung Kanäle schieben. Stellen Sie den Luftdruck bis 5 psi. Es wird empfohlen, die &quot;Sandwich&quot; und die Adresse Ventilen ersten füllen, um cross-Gespräche zwischen Steuerkanäle defekte Geräte zu identifizieren. Im Falle eines Cross-Talks, wird die Betätigung der &quot;Sandwich&quot;-Steuerleitung mit der Betätigung entweder des Halses oder Taste Steuerleitungen führen. Dies ist ähnlich wie bei einem Kurzschluss in einer elektrischen Schaltung. Ein Gerät mit Übersprechen ist defekt und kann nicht verwendet werden. </li><li> Nachdem alle Kanäle und Ventile voll von DDW sind, werden die Ventile grundiert und ready die Strömungskanäle unter ihnen zu blockieren. Erhöhen Sie den Luftdruck bis 15 psi. Ventilansteuerung wird aus einer LabVIEW-Programm durch einen Satz von Ein / Aus-Schalter verbunden ist, um einzelnen Magnetventile gesteuert. Jeder Schalter steuert eine spezielle Steuerleitung durch die entsprechende Magnetventil. Einschalten der Schaltknopf (im Skript) gilt Luftdruck in dem entsprechenden Rohr. Der Luftdruck wird die DDW in der Steuerleitung schieben und wird in den Ausbau der mikrofluidischen Ventilen führen, die Blockierung der Kanal unterhalb. Ausschalten ein Regelventil, löst den Luftdruck und anschließend loslassen Blockierung des jeweiligen Strömungskanal. </li><li> Um sicherzustellen, dass alle Ventile offen sind, einen Schlauch mit einem der Eingänge und Strömung Strömung Luft in die Vorrichtung bei 4-5 psi. Dies setzt keine klebrige Ventile aus dem Glasträger. </li><li> Schließlich wird das Gerät grundiert und bereit. Alle schließen die Eingabe und &quot;Hals&quot;-Ventile, um die Oberflächenchemie starten. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Surface Chemistry <ol><li> Um die Selbstorganisation eines Protein-Arrays auf der Oberfläche zu erleichtern und zu verhindern, unspezifische Adsorption innerhalb der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Oberfläche chemisch modifiziert: </li><li> Um eine Komponente durch die Vorrichtung fließen, schließen ein neues Rohr mit der erforderlichen Lösung für eines der Strömungskanäle in der Vorrichtung. Verbinden Sie das freie Seite des Rohres in der Bedienungsanleitung vielfältig und öffnen Sie den Luftdruck Flow (5 psi). </li><li> Legen Sie 40 ul Biotinylated-BSA (1 ug / ul) in ein neues Röhrchen und fließen etwa die Hälfte davon für 20 min durch das Gerät wird die BSA zu dem Epoxid Oberfläche binden. </li><li> Verwenden Hepes (50 mM) zum Waschen unreagierten Substrats zwischen jeder der verschiedenen Schritte Oberflächenchemie. </li><li> Flow 25 ul Strepavidin (0,5 ug / ul) für 20 min auf der Oberseite des biotinylierten BSA. </li><li> Waschen mit Hepes für 5 min. </li><li> Schließen Sie die &quot;Taste&quot; Ventil und fließen den Rest des biotinylierten-BSA (wie beschrieBett oben), Passivierung der Oberfläche rund um die Taste. </li><li> Waschen mit Hepes für 5 min. </li><li> Lassen Sie die &quot;Taste&quot; Ventil und Flow 30 ul penta-His-Biotin (0,16 ug / ul) für 20 min. Der Antikörper wird an den exponierten Strepavidin binden; spezifisch an die Fläche unter der &quot;Taste&quot; Erzeugen eines anti-His-Tag-Array. </li></ol> 5. Proteinexpression <ol><li> Drücken die Proteine ​​auf dem Gerät mit Kaninchen-Retikulozyten schnelle gekoppelten Transkription und Translation Reaktion. Proteinexpression von den gefleckten synthetischer Gene auf dem Gerät erstellt ein Array von Proteinen einsatzbereit. Beispielsweise ist eine solche Verwendung für eine Proteinbindung Bildschirm. </li><li> Öffnen die &quot;Hals&quot;-Ventile und Durchfluss Kaninchenretikulozyten praktischen gekoppelte Transkription und Translation Reaktion durch die Vorrichtung in die DNA Kammer. Als nächstes schließen Sie die &quot;Sandwich&quot;-Ventile und trennen Sie die einzelnen Gens von seiner Umgebung. Inkubieren der Vorrichtung auf einer heißen Platte für 2,5 h bei 30 ° C. Expressed proteins wird von der DNA-Kammer in die Reaktionskammer spontan (Hals Ventil offen) und Binden an den Anti-His-Antikörper diffundieren unter der &quot;Taste&quot; Ventil Immobilisieren des Proteins über seinen C-Terminus-Tag. </li><li> Beschriften Sie die Proteine ​​mit C-myc Cy3 Antikörper. Der Antikörper wird auf seiner entsprechenden Epitop auf dem Protein N-Terminus lokalisiert binden. </li><li> Bestimmen Proteinexpression Ebenen mit einem Microarray-Scanner (LS Reloaded, Tecan) mit einem 532-nm-Laser und 575 nm Emission Filter. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein. Vorrichtung Fabrication Ein Grafik-Design für das Gerät wurde von AutoCAD auf der Grundlage unserer experimentellen Anforderungen erstellt. Die Konstruktion wurde auf eine transparente Folie von einer hochauflösenden Bildeinstelleinrichtung gedruckt. Diese Transparenz dient als Photomaske in Berührung Photolithographie. Eine Oberflächen-Mikromechanik-Technik wurde verwendet, um 3-D-Templates auf einem Silizium-Wafer, der durch die Muster auf t eingeschrieben bestimmt erstellenEr Masken verwendet. Die Mikrofluidik-Vorrichtung wurde am Silikonform hergestellt Gießen Silikonelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) (Abbildung 1). Jede Vorrichtung besteht aus zwei ausgerichteten PDMS Schichten, die Strömung und die Hemmschicht. Die Form wurde zum ersten Mal Chlortrimethylsilan (TMCS, Aldrich) Dampf für 10 min zu Elastomer-Freisetzung nach den Backschritte Förderung ausgesetzt. Ein Gemisch aus Silikon basierenden Elastomer und Härtungsmittel wurde in zwei unterschiedlichen Verhältnis 5:1 und 20:1 für die Kontrolle und Strömung Formen, jeweils hergestellt. Die Steuerungsschicht wurde entgast und für 30 min bei 80 ° C. Die Strömung Schicht wurde zunächst aufgeschleudert (Laurell, USA) bei 2600 UpM für 60 Sekunden gebacken und bei 80 ° C für 30 min. Die Steuerung Schicht wurde aus seiner Form getrennt und Steuerkanal Zugang Löcher wurden ausgestanzt. Als nächstes wurden die Fluss und Steuerschichten manuell unter einem Stereoskop ausgerichtet bedeckt und für 2 Stunden bei 80 ° C. Die zweischichtige Gerät wurde f geschältrom die Strömung Schimmel und Strömungskanäle Zugang Löcher gestanzt. 2. Device Description Die Vorrichtung Kapazität von 500 bis 10.000 Einheitszellen (Abbildung 2) reichen. Das Gerät besteht aus zwei Schichten, von strömenden Schicht (grau) und Control Layer (Farbe). Die Steuerungsschicht enthalten eine Vielzahl von Ventilen mit unterschiedlichem Funktion. Jede Einheitszelle in Strömungsrichtung Schicht wird von einem DNA und eine Reaktionskammer zusammengesetzt und wird durch drei Typen von mikromechanischen Ventilen gesteuert wird; &quot;Hals&quot;, &quot;Taste&quot;, und &quot;Sandwich&quot; (Abbildung 2A). Ein gefleckter &#39;synthetischen Gens&#39; abgeschieden innerhalb der DNA-Kammer wird von der Reaktionskammer durch den &quot;Hals&quot; Ventil (grün) blockiert. Einfangen und mechanischen Waschen von Oberfläche gebundenen Proteine ​​in der Reaktionskammer wird durch den &quot;Tasten&quot;-Ventil (blau) durchgeführt. Die &quot;Sandwich&quot;-Ventil ermöglicht jede Reaktion in einer eigenen Einheitszelle (rot) auftreten. Die Adresse Ventile aufgeteilt das Gerät bis zu 8 unabhängigen Abschnitten, für different Zustand Assay. Darüber hinaus enthalten die Steuerschicht Eingang Ventile, die den Fluss des Fluids in den ausgewählten Strömungsschicht aktivieren. Die PDMS Steuerkanäle sind voll mit DDW. Wenn ein Ventil der Druckanstieg wird betätigt (15 psi) führt zur Ausdehnung des PDMS. Dort, wo die Membran ausreichend dünn ist (dh Überschreiten der Kontrolle und Fließlinien) ist dies ausreichend, um vollständig die Strömungsleitung. Durchschnittliche Elementarzelle beträgt 10 um, und die durchschnittliche Zellvolumen beträgt weniger als 1 nl. 3. Proteine ​​Expression und Nachweis Die Proteine ​​wurden auf dem Gerät mit Kaninchen-Retikulozyten schnelle gekoppelten Transkription und Translation Reaktion (Promega) ausgedrückt. Die Expression der Proteine ​​erzeugt eine Reihe von Proteinen bereit für den Einsatz in einem verbindlichen (Abbildung 3). Ein Ausdruck Mix (12,5 ul) wurde in das Gerät geladen und dann in die DNA geflutet Kammern durch Öffnen der &quot;Hals&quot;-Ventile. Als nächstes wurden die &quot;Sandwich&quot;-Ventilengeschlossen Verlassen jede Einheitszelle von ihren benachbarten Zellen und der Vorrichtung getrennt auf einer heißen Platte für 2,5 h bei 30 ° C inkubiert Exprimierten Proteine ​​durch das Gen Kammer in die Reaktionskammer, wo ihren C-Terminus His tag binden die Anti-His-Antikörper (Qiagen) unter der &quot;Taste&quot; Ventil Immobilisieren des Proteins auf der Oberfläche lokalisiert könnte diffundiert. Proteine ​​wurden mit einem C-myc Cy3 (Sigma), das zu seinem entsprechenden Epitop auf dem Protein N-Terminus lokalisiert gebunden und markiert sie markiert ist. Protein-Expressionsniveaus wurden mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung (LS Reloaded, Tecan) unter Verwendung eines 532-nm-Laser und 575 nm-Filter bestimmt. Das resultierende Protein-Array besteht aus unterschiedlichem Proteinexpression. Üblicherweise scheitern etwa 20% einer Genbank zu nachweisbaren Mengen exprimieren. Keine Korrelation mit Größe des Proteins wurde 3 beobachtet. Hintergrund wurden unter Verwendung Kammern, die nicht mit DNA wurden gesichtet. Somit sind Signale aus den entsprechenden Kammern Proteins aufgrund entweder noise oder unspezifische Adsorption der Markierung von Antikörpern. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Chipfertigungstechnologie. (A) Formen wurden mit TMCS Dämpfe für 10 min behandelt. (B) PDMS basiert auf Kontrolle und Flow Silikonformen gegossen. (C) Beide Steuerung und Flow Formen werden in 80 ° C für 30 min gebacken. (D) Die Steuerung Schicht der Form geschält, geschnitten, um Größe und Steuereingänge gestanzt. (E) Das Control-Schicht ist mit dem Strömungsschicht unter einem Stereoskop ausgerichtet und dann in 80 º C für 2 Stunden. Parallel zur PDMS Bauelementherstellung wird eine Reihe von synthetischen Genen auf Epoxy beschichtete Glassubstrate (CEL Associates) microarrayed. (F) Die Vorrichtung wird dann mit der DNA-Mikroarray Einfangen der &#39;synthetische Gene&#39; innerhalb der DNA Kammern ausgerichtet sind. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein Foto des PING Device. (A) Das Gerät consist von zwei aligned PDMS Schichten (Steuerung und Durchfluss). Der Fluss Schicht enthält parallel DNA und Reaktionskammern (grau) mit mikromechanischen Ventilen (&quot;button&quot;, &quot;sandwich&quot; und &quot;Hals&quot;) in der Kontrollgruppe Schicht gesteuert. (B) Die Schichten werden auf einer gedruckten Microarrays, die Programme, die jeweils DNA Kammer mit einem einzigen Punkt ausgerichtet. Dadurch entfällt eine mögliche Verunreinigung. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Fluoreszierende Bilder eines Protein-Arrays mit einem Mikrofluidik-Chip erstellt. Die bedruckten Stelle Gene wurden mit Proteinen innerhalb der Vorrichtung (in der DNA-Kammer) ausgedrückt und wurden bis auf die Oberfläche gezogen wird (unterhalb der &quot;Button&quot;, das in der Reaktionskammer) durch ihre C-Terminus His-Tag. Proteinexpression wurde unter Verwendung ihrer C-myc-Tag N-Terminus und einer spezifischen fluoreszierenden Antikörper. Unterschiedlichen Signalintensitäten zeigen unterschiedliche Proteinexpression Ebenen. Un-spotted Kammern dienten als Kontrollen für Hintergrund levels.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Papier stellen wir eine Methode zur Erzeugung Protein-Arrays im High-Throughput mit einer mikrofluidischen Plattform. Das Array Generation ist auf Microarray Bedrucken von DNA-Matrizen und in vitro-Proteinexpression von der DNA innerhalb der Mikrofluidik-Vorrichtung basiert. Unser neuartiger Mikrofluidik-Plattform hat mehrere wichtige Vorteile gegenüber derzeit verwendeten Methoden, die es zu einem vielversprechenden und allgemeines Werkzeug für die Proteomik zu machen. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Chlortrimethylsilan (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Epoxy beschichtete Glassubstrate </td><td> CEL Associates USA </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poly Ethylen Glykol (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-Trehalosedihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinyliert-BSA </td><td> Durchstechen </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidin </td><td> Durchstechen </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-Biotin </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biological Industries</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc-Antikörper Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Kontrollkästchen </td><td> Stanford Microfluidics Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Form </td><td> Stanford Microfluidics Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Merken </td><td> New England Small Tubes Konzern </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore Schlauch </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robotics </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Silikon Stifte </td><td> Parallel SynThese </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Rapide steigende Bereichen wie der Systembiologie, erfordert die Entwicklung und Umsetzung neuer Technologien, so dass High-Throughput-und High-Fidelity-Messungen von großen Systemen. Mikrofluidik verspricht viele dieser Anforderungen erfüllen, wie zum Beispiel die Durchführung High-Throughput-Screening-Experimenten auf dem Chip, umfasst biochemischer, biophysikalischer und Zell-basierte Assays 1. Seit den frühen Tagen der Mikrofluidik-Geräten, hat dieses Feld drastisch entwickelt, die zur Entwicklung von mikrofluidischen large-scale integration 2,3. Diese Technologie ermöglicht die Integration von Tausenden von mikromechanischen Ventilen auf einem einzigen Gerät mit einem Porto-sized Fußabdruck (Abbildung 1). Wir haben einen hohen Durchsatz mikrofluidischen Plattform zur Erzeugung in vitro Expression von Protein Arrays (Abbildung 2) genannt PING (Protein Interaction Network Generator) entwickelt. Diese Arrays können als Template für viele Versuche dienenwie Protein-Protein-4, Protein-RNA 5 oder Protein-DNA-Wechselwirkungen 6. Das Gerät besteht aus Tausenden von Reaktionskammern, die individuell programmiert werden mit einer Microarrayer. Ausrichten dieser gedruckten Mikroarrays Mikrofluidik Vorrichtungen Programme jede Kammer mit einer einzigen Stelle eliminiert potentielle Kontamination oder Kreuzreaktivität Außerdem Erzeugen Mikroarrays unter Verwendung von Standard-Mikroarray Spotting Technik ist auch sehr modular, so dass für die Ordnungsabschnitt von Proteinen 7, 8 DNA, kleine Moleküle, und sogar kolloidalen Suspensionen. Die möglichen Auswirkungen der Mikrofluidik auf biologischen Wissenschaften ist signifikant. Eine Reihe von Mikrofluidik basierte Assays wurden bereits neue Einblicke in die Struktur und Funktion von biologischen Systemen vorgesehen und der Bereich der Mikrofluidik weiter Biologie beeinflussen.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Aufrufe.  Bar-Ilan University. Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

Serie: High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Forschung

Biotechnik

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...