Transplantationsmodelle sind wertvolle Werkzeuge für die immunologische Forschung, die oft chirurgisches Fachwissen erfordern. Hier stellen wir einen praktikablen Ansatz für die heterotopische Herz- und Herzmuskelzelltransplantation bei Ratten vor. Durch die Hervorhebung und Vereinfachung aller wichtigen Schritte unseres Modells sollten Forscher ohne chirurgischen Hintergrund in der Lage sein, dieses Modell in einer angemessenen Zeit zu meistern.
Beide Transplantationsmodelle liefern wertvolle Einblicke in die Mechanismen von Toleranz und Abstoßung und können bei verschiedenen Arten angewendet werden. Wir haben viel Erfahrung in der Vermittlung dieses Modells für Personen ohne vorherige chirurgische Ausbildung. Nachdem wir die entscheidenden Schritte gelernt haben, raten wir zu Geduld und ausreichender Praxis mit verstorbenen Tieren.
Für Spender Herzexplantation, nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex in anästhesierten sieben bis 22 Wochen alten Ratte Spender Tier, wenden Sie Augenschmiermittel und verwenden mechanische Clippers, um das Bauch- und Brustfell zu entfernen. Legen Sie die Ratte in die Supine-Position auf einem Heizsockel und fixieren Sie die Gliedmaßen an der Basis des Operationstisches mit elastischen Bändern. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol und führen Sie eine mediane Laparotomie durch.
Setzen Sie Retraktoren in den Schnitt ein und verwenden Sie sterilisierte Wattestäbchen, um den Darm auf der linken Seite des Spenders zu mobilisieren, um die minderwertige Vena cava freizulegen. Als nächstes punktieren Sie die minderwertige Vena cava, um eine intravenöse Injektion von 500 Internationalen Einheiten von Heparin zu ermöglichen, die in einem Milliliter eiskalter isotonischer Salinelösung gelöst sind. Stoppen Sie die Blutung an der punktierten Stelle nach dem Zurückziehen der Nadel durch leichte Kompression mit einem Wattestäbchen.
Schneiden Sie das Zwerchfell, führen Sie eine seitliche Thorakotomie auf beiden Seiten des Spenders und pin die Thoraxwand. Entfernen Sie das Perikard und den Vagalnerv durch stumpfe Vorbereitung mit zwei Mikronadelhaltern. Für die Exsanguination, transsektieren Sie die Bauchgefäße und setzen Sie den stumpfen Ast einer Sonde spitze Schere in die quere perkardiale Sinus.
Verwenden Sie eine Kompresse, um die aufsteigende Aorta und Lungenarterie so distal wie möglich unter leichter kaudaler Zugkraft des Herzens zu sezieren. Legen Sie eine einzelne 5-0 Ligatur um die überlegene und unterlegene Venenhöhle und die Lungenvenen und straffen Sie die Ligatur stufenweise so dorsal wie möglich. Trennen Sie das Gewebe dorsal an die Ligatur und extrahieren Sie das Herz.
Um das explantierte Herz zu durchdringen, verwenden Sie eine 18 Gauge Kanüle aus einem intravenösen Katheter, um 30 Milliliter eiskalte, isotonische Sarinlösung zu spülen, ergänzt durch 1000 Internationale Heparineinheiten durch die aufsteigende Aorta und die Lungenarterie, bevor Sie das Herz in eine 15-Milliliter-Röhre der Sarinlösung auf Eis legen. Nach der Vorbereitung der 10 bis 14 Wochen alten Empfängerratte, wie gerade gezeigt, mobilisieren Sie den Darm auf der oberen linken Seite des Empfängers auf eine warme, nasse Kompresse. Und stellen Sie das Operationsmikroskop oder eine ausreichende Alternative ein.
Nach der Mobilisierung des Zwölffingerdarms bzw. des proximalen Jejunums, mit einer fünf bis sieben vollen Vergrößerung, verwenden Sie Wattestäbchen und stumpfe Sezierung, um die Bauchaorta und die minderwertige Vena cava zu entblößen. Mit zwei Mikronadelhaltern, um die Bauchgefäße zu erhöhen, ohne die Lendenvenen zu verletzen, legen Sie eine Cooley Gefäßklemme auf die Gefäße. Verwenden Sie eine 30 bis 45 Grad gewölbte 27 Gauge Kanüle, um die Bauchgefäße zu punktieren.
Und verwenden Sie die Potts-Schere, um die Punktionsstelle zu einem Längsschnitt zu vergrößern, der der Größe des Lumens der Spendergefäße entspricht. Um Gerinnsel zu entfernen und eine postoperative Thrombose zu verhindern, durchdringen Sie die Gefäße mit Saline und legen Sie das Transplantat in den Situs. Mit zwei einfachen unterbrochenen 8-0 monofilament nicht resorbierbare Nähte, fixieren Sie den Spender aufsteigende Aorta an der Empfänger-Bauch-Aorta an den schädel- und kaudalen Ecken des Längsschnitts.
Um die aufsteigende Aorta des Spenders mit der Bauchaorta des Empfängers zu anastomose, stellen Sie das Transplantat rechts von den Empfängergefäßen, während Sie die erste Hälfte der Anastomose mit einem laufenden 8-0 Monofilament-Nähte. Legen Sie dann das Transplantat auf der linken Seite der Empfängergefäße und führen Sie die zweite Hälfte der Anastomose. Fixieren Sie die Spender-Lungenarterie in ähnlicher Weise an der unteren Vena cava mit zwei Eckknoten an den Schädel- und Kaudalen.
Nachdem Sie das Spendergefäß an jeder Ecke mit Knoten fixiert haben, legen Sie einen Stich von außen nach innen des Gefäßes, um eine intraluminale Anastomose für die erste Hälfte der Anastomose zu betreiben. Bevor Sie die Naht binden, legen Sie einen weiteren Stich von innen nach außen. Um periphere Embolie nach Abschluss der zweiten Hälfte der Anastomose zu verhindern, spülen Sie die Anastomose mit Einer Linie, bevor Sie den Knoten der zweiten Hälfte der Anastomose anziehen.
Legen Sie eine hämostatische Gaze um beide Anastomosen und lösen Sie vorsichtig die Cooley Gefäßklemme, um eine Transplantatreperfusion zu ermöglichen. Verwaltung von Blutungen mit leichter Kompression und sterilisierten Wattestäbchen. Nach etwa 60 Sekunden sollte das Herz zu schlagen beginnen.
Ersetzen Sie den Darm sorgfältig und schließen Sie die Bauchfaszie und die Haut mit separaten kontinuierlichen 3-0 Polyfilament-Laufnähten. Zum geeigneten Versuchszeitpunkt ein Spenderrattenherz ernten, wie gezeigt, und verwenden Sie ein steriles Skalpell oder eine sterile Schere, um das Herz in drei mal drei Millimeter Fragmente zu zerkleinern. Verdauen Sie die Stücke in 20 Milliliter Kulturmedium ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Verdauung, fügen Sie das Gewebe zu einem großporigen Sieb, während das Kulturmedium zu entfernen. Fünf bis 10 Milliliter isotonische Salinelösung hinzufügen und die Gewebeschlämme durch das Sieb belasten. Und nach dem Zentrifugieren der Zellsuspension zweimal, filtern Sie es durch ein 40 Mikrometer Zellsieb.
Spülen Sie das Sieb mit fünf bis 10 Milliliter isotonischen Saline-Lösung, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Und nach der Zentrifugation die isolierten Rattenherzzellen in einer Salinelösung in einer Konzentration von fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter wieder aussetzen. Legen Sie eine 1 Milliliter Spritze mit der Zelllösung und legen Sie das anästhesierte Empfängertier in eine seitliche Position mit dem Zielohr nach oben.
Fixieren Sie das Ohr mit einem Finger und doppelseitigem Klebeband, und verwenden Sie eine 27 Gauge Kanüle, um 20 Mikroliter Herzmuskelzelllösung in der Nähe der visuellen Kapillargefäße in das Ohr des Empfängers subkutan zu injizieren. Nach der entsprechenden experimentellen Beobachtungsphase die entwässernden zervikalen Lymphknoten extrahieren und die entsprechenden nachgelagerten Analysen von Interesse durchführen. Syngene Transplantationen überlebten bis zu 100 Tage ohne Anzeichen eines Transplantatversagens.
Die spezifische Spender-Empfänger-Kombination kann zu unterschiedlichen Geschwindigkeiten der heterotopischen Herztransplantationsabstoßung führen. Kryostatabschnitte der abgelehnten Herzen zeigen eine zunehmende Infiltration von Immuneffektorzellen, während syngene Transplantate weitgehend frei von Immunzellen sind. Zervikale Lymphadenektomie und Restimulationstests von entwässernden Lymphknotenzellen nach oraler Herzmuskelzellinjektion zeigen bei allogenen Transplantationsempfängern ausgeprägte dehnungsspezifische Immunreaktionen auf heterotopisches Herzgewebe, was weitere immunologische Analysen wie Zytokinprofilierung rechtfertigt.
Behandeln Sie die Gefäße beim Einsetzen und Extrahieren der Nadel sorgfältig. Legen Sie nicht zu viel Aufmerksamkeit auf die Nähte, um Stenose zu verhindern. Legen Sie nicht zu viele Stiche für jede Anastomose.
