Die Wärmeschock-Reaktion ist ein wesentlicher zellulärer Stressreaktionsweg, der die zytoplasmatische Proteostase beibehält und auf molekularer, zellulärer und Organismusebene in Seeeleganen charakterisiert werden kann. Wir präsentieren eine Reihe standardisierter Protokolle und Best Practices, die eine robuste Induktion der Hitzeschockreaktion in Seeeleganen erzeugen, um die Reproduzierbarkeit im Bereich der Hitzeschockreaktion zu verbessern. Wir zeigen, dass Thermotoleranz, ein häufig verwendeter Organismus-Assay, nicht von der Hitzeschockreaktion abhängt.
Stattdessen empfehlen wir die Verwendung von thermischer Rückgewinnung, einem Organismus-Assay, der von der Wärmeschockreaktion abhängig ist. Die Hitzeschock-Reaktion wird mit dem Beginn der Eiablage abgeschwächt. Daher ist das Entwicklungstiming eine kritische Variable, die in Hitzeschock-Reaktionsexperimenten berücksichtigt werden muss.
Erstellen Sie zunächst eine synchronisierte Wurmpopulation. Verwenden Sie einen Platindrahtpick, um etwa 10 gravid erwachsene Würmer auf eine frische Platte zu übertragen. Achten Sie darauf, alle Eier oder Larven zu entfernen, die mit den Erwachsenen übertragen wurden.
Lassen Sie die Würmer Eier für eine Stunde legen, dann entfernen Sie die Erwachsenen von der Platte. Halten Sie die synchronisierten Würmer bei 20 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Entwicklungszeitpunkt mit jedem Stamm und der Temperatur, bei der die Würmer angehoben werden, variiert. Wenn die Würmer für Hitzeschock bereit sind, wickeln Sie die Platten mit Paraffinfolie und verwenden Sie ein Reagenzglasregal mit Bleigewicht, um sie eine Stunde lang in ein zirkulierendes Wasserbad bei 33 Grad Celsius zu tauchen.
Die Platten aus dem Wasserbad bergen und mit einem Papiertuch trocknen. Entfernen Sie den Paraffinfilm und lassen Sie die Würmer sechs bis 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius erholen, was eine ausreichende Zeit für die GFP-Synthese sein wird. Um Dias für die Bildgebung vorzubereiten, positionieren Sie ein Mikroskop-Dia zwischen zwei anderen Dias, auf denen ein Streifen Laborband mit sich zu sehen ist.
Machen Sie eine 3%Agarose-Lösung in Wasser und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle, bis sich die Agarosen auflösen. Verwenden Sie dann eine 1 Milliliter Pipette, um etwa 150 Mikroliter der Agarose in der Mitte der Rutsche zu platzieren. Bedecken Sie das Dia sofort mit einem leeren Dia, platzieren Sie ihn senkrecht, so dass es auf dem Laborband ruht, und entfernen Sie es dann vorsichtig.
Um die Würmer immobilisieren, fügen Sie einen kleinen Tropfen von einem Millimolar-Levamisol, einem M9-Puffer, in die Mitte des Agarose-Pads und übertragen Sie 10 Würmer mit einem Platindrahtpick in den Tropfen. Optional verteilen Sie die Levamisole nach außen des Agarose-Pads und richten Sie die Würmer an der Pick aus, wenn sie gelähmt werden. Bedecken Sie die Würmer mit einem Abdeckschlupf und stellen Sie sie so schnell wie möglich mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.
Um einen Thermorecovery-Test durchzuführen, synchronisieren Sie die Würmer und halten Sie sie bei 20 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Dann Hitze schockt sie für sechs Stunden. Entfernen Sie die Platten aus dem Wasserbad und lassen Sie sie bei 20 Grad Celsius für 48 Stunden erholen.
Zählen Sie nach der Genesung die Anzahl der Würmer, die nach mechanischer Stimulation ohne ruckartige Bewegung oder Lähmung sofort weggerissen werden können. Um die Induktion von Hitzeschockreaktionen auf zellulärer Ebene zu visualisieren, wurden zwei fluoreszierende Reporter-Sea Elegans-Stämme analysiert. In den Negativkontrollproben ohne Hitzeschock zeigte der hsp-16.2-Reporter eine normale Autofluoreszenz, aber der hsp-70-Reporter hatte konstitutive Fluoreszenz im analen Depressivormuskel.
Nach einer Stunde Hitzeschock wurde bei beiden Reportern eine robuste Fluoreszenz beobachtet, als RNAi verwendet wurde, um hsf-1 abzustürzen, bevor die Induktion des Reporters gemessen wurde. Die Fluoreszenz beider Stämme wurde stark reduziert, was darauf hindeutet, dass diese Reporter hsf-1 abhängig sind. Um die Induktion der Hitzeschockreaktion auf molekularer Ebene zu quantitieren, wurden zwei einheimische Hitzeschockproteine mit rt Key PCR gemessen.
Es wurde festgestellt, dass ein einstündiger Hitzeschock von 33 Grad Celsius zu einer mehr als 2000-fachen Zunahme der relativen Expression der beiden Hitzeschockgene führt. Ein Thermorecovery-Test zeigte, dass die Exposition gegenüber einem sechsstündigen Hitzeschock zu einer 20%igen Abnahme von Würmern mit normaler Bewegung nach einer 48-stündigen Erholung führte. Knockdown von hsf-1 verursachte einen dramatischen Rückgang der normalen Bewegung, mit über 95% der Würmer zeigen ruckartige Bewegung oder Lähmung, nachdem sie prodded.
Im Gegensatz dazu hatte der Knockdown von hsf-1 keinen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse eines Thermotoleranz-Assays, bei dem Würmer einer kontinuierlichen Temperatur von 35 Grad Celsius ausgesetzt sind und der Prozentsatz der lebenden Würmer zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen wird. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausführen, stellen Sie sicher, dass Sie die Platten zweimal mit Paraffinfolie umwickeln, um zu verhindern, dass Wasser in die Platten eindringt und das Experiment ruiniert. Molekulare Assays können mit RNA-seq in genomische Analysen erweitert werden.
Andere von der Hitzeschockreaktion betroffene Organismus-Assays können einbezogen werden, z. B. die Lebensdauer. Die einzigartige Fähigkeit, molekulare, zelluläre und organismusliche Hitzeschock-Reaktionstests in Seeeleganen zu korrelieren, hat sich als von unschätzbarem Wert für das Verständnis der Rolle dieses Weges bei Entwicklung und Krankheit erwiesen.
