Die Autoren möchten Danke Heather Currey für ihren ersten Beitrag, das Studiendesign und Dr. Swarup Mitra für seine kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten auch danke Dr. Michael B. Harris für Kommentare, Verbesserungen und Unterstützung bei der Erstellung der Demonstration dieser Methodik. Die Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von den NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Die Forschung in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute Of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis zahlen UL1GM118991, TL4GM118992 oder RL5GM118990 und institutionelle Entwicklung Award (IDeA) unterstützt. das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant Nummer 5P20GM103395-15. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. UA ist AA/EO Arbeitgeber und Bildungseinrichtung und verbietet illegale Diskriminierung einer Person: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis Sieb Konstruktion und Verwendung
<ol><li>
Konstruktionsprotokoll
	<ol>
<li>2 Deckel aus 50 mL konische Röhrchen (Abbildung 1A) zu erwerben.</li>
		<li>Entfernen Sie den mittleren Bereich innerhalb der inneren Lippe der Lider (betrachtet von unten, Abb. 1 b) mit dem Bunsenbrenner und Roheisen Sonde oder einen Lötkolben oder trat Bohrer. Hinweis: Mit Wärme, um die Kunststoff-Deckel zu schneiden ist eine Klinge vorzuziehen, da gibt es weniger Verletzungsgefahr.</li>
		<li>Reinigen Sie und Schleifen Sie die Schnittkanten und oben Sie die Oberfläche mit einer gebogene Feile oder einem Rotary Schleifwerkzeug (z.B.Dremel). Siehe Abbildung 1.</li>
		<li>Schneiden Sie den Kreis der das Monofilament Netz auf den entsprechenden Durchmesser (Abbildung 1). Hierzu verfolgen Sie einen Deckel auf einem Monofilament Netz Nylonblatt und schneiden Sie nur innerhalb der Linie gezeichnet.</li>
		<li>Schneiden Sie Nuten/Schrägstriche in die obere Fläche der Deckel zur Verbesserung der Adhäsion von zwei Deckeln, wenn Klebstoff auf den Kunststoff (Abbildung 1E) angewendet wird.</li>
		<li>Die Deckel mit Ethanol zu reinigen und trocknen lassen.</li>
		<li>Cyanacrylat Kleber auf der Oberseite der beiden Deckeln, halten bis zum äußeren Rand. Hinweis: ein wenig Leim geht ein langer Weg.</li>
		<li>Legen Sie das Monofilament Netz gemäß Tabelle 1, auf einem geklebten Deckel (Abb. 1F). Setzen Sie den zweiten Deckel oben auf das Netz invertiert; Beide Deckel müssen ihre Spitzen zusammen. Drücken Sie fest zusammen (Abb. 1). Stellen Sie sicher, dass das Netz straff gespannt ist. Hinweis: als Sicherheitsmaßnahme, Verwendung Pinzette um das Netz auf den Deckeln zu platzieren.</li>
		<li>Sobald die erste Schicht der Leim getrocknet ist, wenden Sie einen Ring aus Cyanacrylat-Klebstoff um die äußeren Lücke zwischen den Deckeln. Seien Sie großzügig, da dies Integrität fügt und jede Peeling auseinander oder undicht verhindert.</li>
		<li>Beschriften Sie den Filter mit einer Pore Maschenweite des Netzes Monofile. Hinweis: Hier verwenden wir zwei Maschengrößen Pore – 20 µm und 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie Protokoll
	<ol>
<li>Vornässen der Sieb.<ol>
<li>Pipette eine Kochsalzlösung, z. B. M9 [5 g NaCl, Na2HPO46 g, 3 g KH2PO4, 1 L von hochreinen H2O und 1 mL MgSO4 (1 M)]17, durch die Mitte des Siebes bis sich ein Tröpfchen bildet , kondensiert und tropft ab der Mitte des unteren Filter (Abbildung 2A). Optional, gelten ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) auf den Boden zu gestalten oder einen Tropfen Feuchtigkeit auf das Netz zu verbreiten.</li>
			<li>Legen Sie das Sieb über eine 50 mL konische Rohr. Beschriften Sie das Rohr als "Abfall-Tube" (Abb. 2 b).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Waschen Sie eine Bevölkerung von C. Elegans aus einer nährbodenplatte.<ol>
<li>Waschen der Platte mit der M9-Puffer und der Wurm-haltigen Medium auf der Oberseite der Monofilament Netz 1 mL zu einem Zeitpunkt (Abbildung 2). Achten Sie darauf, in der Mitte des Netzes zu betreiben. Waschen Sie alle Würmer von der Platte. Hinweis: In der Regel 3 mL M9 für eine 60 mm-Platte ist ausreichend.</li>
			<li>Um die Anzahl der Würmer in pipettieren verloren zu minimieren, verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette, um die Würmer aus der Platte und in das Netz-Zentrum (Wiederholung nach Bedarf) zu bewegen.</li>
			<li>Spülen Sie den Filter mit dem M9-Puffer von oben. Wieder, stellen Sie sicher, in der Mitte des Netzes zu betreiben und spülen alle Würmer in diesem Bereich. Waschen Sie sich so oft wie notwendig, um sicherzustellen, dass das Netz die Bakterien und kleinere Würmer durchlaufen haben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ernten Sie die Größe angepasst Tiere vom Sieb.<ol>
<li>Legen Sie eine neue 50 mL konische Rohr an die Spitze des Siebes mit der erwachsenen Würmer aus Schritt 1.2.2.3 mit Blick auf das Innere der neuen Kollektion-Röhre (Abb. 2D).</li>
			<li>Entfernen Sie das erste Rohr (Abwasser Rohr) und Blättern Sie schnell über das Sieb und die neue Röhre, die Tröpfchen von Migration zu halten (Abbildung 2E). Hinweis: Wenn Sterilität nicht erforderlich ist, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (z.B.windex) Docht Fluid von Unterseite des Netzes vor spiegeln.</li>
			<li>Spülen Sie das Netz mit M9 in der neuen 50 mL Tube aus der neuen Oberseite (Abb. 2F). Wieder in das Netz-Zentrum Betrieb und Wartung ein Tröpfchen auf der Unterseite des Netzes.</li>
			<li>Ermöglichen die Würmer zu begleichen oder sanft nach unten zu drehen (z.B.< 16 X g) für ca. 1 min (Abbildung 2).</li>
			<li>Aspirieren die Pufferlösung aus dem Pellet von Würmern, im Idealfall bis zu > 0,5 mL, oder entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören das Pellet.</li>
			<li>Die Würmer mit einem Glas Pasteurpipette auf einem Teller NGM Pipette und trocknen lassen. Raum mehrere Tröpfchen heraus auf eine neue Platte, damit sie schneller (Abb. 2 H Trocknen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinigen Sie Sieb.<ol>
<li>Das Sieb sanft und gründlich mit Ethanol und Umkehrosmose-Wasser abspülen. Lassen Sie ihn trocknen.</li>
			<li>In einen sauberen Behälter für unbestimmte zukünftige Verwendung speichern.</li>
			<li>Entsorgen Sie es, wenn das Netz ein "Sag" Erscheinungsbild entwickelt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Validierung der Caenorhabditis Sieb Sortiermethode
<ol><li>Allgemeine Wartung
	<ol>
<li>Für alle Experimente Kultur worms auf eine standard Nematoden Wachstumsmedien17 (1 L der NGM besteht aus 2,5 g Pepton, 17 g Agar, 3 g NaCl, 975 mL bidestilliertem Wasser, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4und 0,5 mL von 100 mg/mL Streptomycin) bei 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentelle Behandlung Verwaltung
	<ol>
<li>Vergleichen Sie die drei Behandlungsgruppen: Pick, Fluorodeoxyuridine (FUDR) und Caenorhabditis Sieb.<ol>
<li>Für die Behandlungsgruppe FUDR die NGM-Medien, um eine Endkonzentration von 100 μM, Nachkommen-Produktion zu verhindern 100 mg/mL FUDR hinzu, und übertragen Sie die Würmer täglich auf einen frischen NGM Teller Essen Erschöpfung zu vermeiden.</li>
			<li>Markieren Sie für die Pick Gruppe und übernehmen Sie die Würmer manuell mit einer Platin-Schleife.</li>
			<li>Folgen Sie für die Behandlungsgruppe Caenorhabditis Sieb Schritt 1.2 und pipette die Würmer auf eine NGM-Teller.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Sieb prozentuale Ausbeute
	<ol>
<li>Um zu quantifizieren, wie effektiv das Sieb ist zur Sortierung von C. Elegans, Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 1 des Erwachsenenalters bei 25 ° C (d. h.48 h nach der Eiablage) wachsen und übertragen sie dann durch Abnehmen ihnen frische NGM-Platten (in Höhe von insgesamt N = 50 oder N = 100 Tiere pro Tre Atment Gruppe).</li>
		<li>Nach 24 Stunden der Erholung, transfer die Bevölkerung zum neuen NGM Platten mit Caenorhabditis Sieb nach oben-Protokoll (siehe Schritt 1.2) und die Anzahl der erfolgreich übertragenen Tiere.</li>
		<li>Berechnen Sie die prozentuale Ausbeute als das Verhältnis der Anzahl der Tiere im Vergleich zu der Startnummer zu Beginn der Übertragung multipliziert mit 100 (%) übertragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan assays Hinweis: Gäste Healthspan Parameter der Motilität Klasse, der pharyngealen Pumprate und sowohl die vorderen und hinteren sanften Touch-Reaktion an Tagen 2, 4, 6 und 8 des Erwachsenenalters für Alter synchronisiert N2 Tiere gepflegt bei 25 ° C.<ol>
<li>Motilität tracking<ol>
<li>Motilität Partituren basiert auf einem Klasse-basierte System (Klassen A, B und C) weisen nach den Methoden von Herndon Et Al. 18. vergleichen Sie die Auswirkungen der drei experimentellen Gruppen anhand eines ordinale logistische Statistiken im statistischen Analyse-Software. Hinweis: Klasse A Personen bewegen sich spontan in einem normalen, sinusförmige Muster. Klasse B Personen bewegen sich in deutlich nicht-sinusförmige Bewegungen und möglicherweise drängen um Bewegung zu fördern. Klasse C Individuen bewegen Sie ihren Kopf und/oder Schweif als Reaktion auf Drängen aber nicht über den Agar bewegen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pharyngealen Pumprate<ol>
<li>Zählen Sie die Mühle Bewegung des Tieres terminal pharyngealen Glühbirne visuell unter einem Stereomikroskop bei einem 600 X letzte Vergrößerung für 1 min.</li>
			<li>Eine statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Touch-Reaktion<ol>
<li>Erfassen Sie eine sanfte Berührung Reaktion und vergleichen Sie zwischen den drei Behandlungsgruppen. Führen Sie die Tests basierend auf den Methoden von Calixto Et Al. beschrieben 19.</li>
			<li>Aufzeichnung der vorderen und hinteren touch-Reaktion durch sanft streichelte eine Wimper Pick senkrecht über der Rute oder der Kopf (5 X, abwechselnd Kopf und Schweif) der Tiere.</li>
			<li>Erhalten Sie jede Bewegung in die entgegengesetzte Richtung des Pinselstrichs als 1 Punkt auf einer Skala von 0 bis 5 für die vordere und die hintere Antwort.</li>
			<li>Statistische Analyse mit einem One-Way ANOVA mit α = 0,05 und Bonferroni Post-Tests mit α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Fruchtbarkeit-assay
	<ol>
<li>Um die Verwendung von Caenorhabditis Sieb Auswirkungen auf die Fortpflanzung zu ermitteln, wachsen Sie Alter-synchrone N2 Tiere an Tag 2 des Erwachsenenalters bei 25 ° C.</li>
		<li>60 h nach Ei zu legen, Tiere auf neue NGM-Platten mit Platin holen oder Caenorhabditis Sieb übertragen und Ihnen 4 h zu erholen (trocken gesiebten Platten für 20-30 min).</li>
		<li>Geben Sie nach seiner Genesung individuell Teller holen die Tiere über eine Wimper NGM Platten ihnen 24 h um Eier zu legen, und entfernen Sie die Tiere. Lassen Sie die Nachkommen auf jeder Platte, unter normalen Bedingungen bei 25 ° C für ein weiteres 24 h zu entwickeln. Hinweis: Eine Wimper-Pick ist eine menschliche Wimpern sicherte sich am Ende einer Pasteurpipette mit Nagellack und sterilisiert mit Ethanol.</li>
		<li>Die Anzahl der lebensfähigen F1 Generation Individuen. Eine statistische Analyse mit einem T-Test mit α = 0,05. Hinweis: Lebensfähige Nachkommen gelten als Eier, die erfolgreich auszubrüten und beginnen ihre Entwicklung durch die regelmäßigen Larven Zyklen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszierende Reporter Stress-Reaktion-assays
	<ol>
<li>Führen Sie drei häufigsten verwendeten fluoreszierenden Reporter Assays um potentielle Marker von Stress zu erkennen: ein DAF-16::GFP Translokation in den Kernen der Zellen in einem Stamm [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; Rol-6)]20; Hsp-16,2 Ausdruck [TJ375-gpIs1 (Hsp-16.2p::GFP)]21; und ein Sod-3 Ausdruck [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Kultur für jeden Test, Alter-synchrone Tiere aus den drei Behandlungsgruppen bei 20 ° C und am Tag 3 des Erwachsenseins zu untersuchen: Verwenden Sie eine Negativkontrolle (auf einer täglichen Basis übertragen eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick), eine Positivkontrolle (auf einer täglichen Basis eine Gruppe von Tieren manuell mit einem Platin Pick plus eine etablierte Stressor übertragen), und das Sieb Caenorhabditis (die Tiere durch das Sieb passieren und es ihnen ermöglichen, für 30 min auf NGM kurz vor Bildgebung zu erholen).</li>
		<li>In der DAF-16::GFP-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere bei 37 ° C für 30 min vor der imaging-20. Für die Hsp-16,2-Assay Hitze Schock die Positivkontrolle Tiere für 90 min, 20 h vor dem imaging-21. Für die Sod-3 Test behandeln Sie die Positivkontrolle Tiere mit 100 mM Paraquat für 4 h vor imaging22.</li>
		<li>Ernte die Würmer sofort mit einer Wimper Pick aus und Klebe sie auf einem deckgläschen mit 1 μl einer 36 % Poloxamer 407 Tensid-Lösung, die Würmer zu immobilisieren.</li>
		<li>Die montierten Würmer mit einem anderen Deckglas Sandwich. Montieren Sie zwei Deckgläsern zu einem Standardglas Mikroskopie Folie und Bild der Würmer mit einer 8 X Vergrößerung auf einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (für eine allgemeine Vergrößerung von 80 X) und eine ständige Exposition mit einem FITC-Filter.</li>
		<li>Um Unterschiede zwischen den drei Gruppen in der DAF-16::GFP-Assay zu erkennen, zu kategorisieren die Tiere anhand der Position der DAF-16::GFP-Reporter (Kern-, wenn die Reporter, Kerne, cytosolischen umgesiedelt, befindet sich die Reporter in Cytosol und Mittelstufe, wenn der Reporter befindet sich in Kernen und Zytosol).</li>
		<li>Vergleichen Sie die Ergebnisse unter Verwendung eines ordinalen Logistik statistischen Modells in statistische Analyse-Software. Für die Hsp-16.2 und die Sod-3 Ausdruck Assays, verwenden Sie eine einfache ANOVA mit α = 0,05 und Tukey post Hoc Tests mit α = 0,05 um die totale Fluoreszenz des Kopfes zu vergleichen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Hier haben wir die Gestaltung und Nutzung der zugänglichen, effektive Caenorhabditis Sieb als Werkzeug für die Sortierung und Pflege C. Elegans. Dieses Tool hat mehrere Vorteile, manuell auswählen einzelner Tiere, Wasch-Populationen, chemische Behandlungen (z.B.FUDR) und teurer Methoden der Trennung Tiere. Erstens die Caenorhabditis Sieb schnell und effizient (weniger als 20 min) sortiert Nachkommen aus großen gemischten Populationen von Tieren (Tabelle 2). Auch di...

Die Nematoden Wurm Caenorhabditis Elegans, ist eine führende Modellorganismus. Neben der einfachen und kontrollierten Natur ihrer Züchtung im Labor ihre gesamte Genom sequenziert1 und Entwicklungsstörungen Schicksal jeder Zelle ist bekannt2. Aufgrund dieser Eigenschaften ist C. Elegans weit verbreiteten Modellorganismus für genetische Studien. Zusammen mit diesen vorteilhaften Eigenschaften kommen jedoch einige Herausforderungen für Forscher. Aufgrund ihrer schnellen Generationszeit C. Elegans Populationen können schnell laufen aus der Nahrung und/oder Populationen mit mehreren Generationen vermischt werden und Entwicklungsstadien auf einmal präsentieren. Folglich erfordern Experimente auf solide Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Forscher körperlich bewegen Tiere zu frischen Teller, bevor die bakterielle Nahrungsquelle erschöpft und neue Larven entwickeln. Dies kann mühsam sein, da eine häufige Übertragung der Tiere erforderlich ist, um zu verhindern, dass die experimentellen Populationen von mit Nachkommen Generationen vermischt. Jedoch erfordern einige Experimente sowohl große Anzahl von Tieren und längere Zeitpunkte (z.B. DNA oder RNA-Extraktion im Erwachsenenalter). Dies verstärkt die Entwicklung genau zu erhalten eine synchronisierte Bevölkerung und große Zahl von Tieren übertragen.
Aktuelle Methoden der Übertragung von C. Elegans kultiviert auf NGM Kommissionierung oder Waschen der Tiere von Platte zu Platte; chemische Behandlung der Tiere (z. B.mit der DNA-Replikation-Inhibitor Fluorodeoxyuridine oder FUDR); oder mittels Durchflusszytometrie, um die Tiere im Multi-well-Platten zu sortieren. Kommissionierung beinhaltet die Verwendung von ein Handwerkzeug, gemacht mit einer dünnen Platindraht oder eine Wimper manuell einzelne oder mehrere Tiere3,4übertragen. Diese Methode ist korrekt, aber erfordert Geschick und Zeit und ist eine Einschränkung für Studien, die große Zahl von Tieren. Mai auch sein körperlich schädlichen und stressig für die Tiere durch potenziell Personen unnatürlich und inkonsistente Mengen von Störung und Kraft zu unterwerfen. Waschen umfasst Spülen einer Kulturschale mit einer Pufferlösung und die Lösung mit den Tieren über Glas Pasteurpipette auf eine neue Kultur-Platte zu übertragen. Diese Methode ist schnell und effizient aber ist nicht genau, wie mehrere Generationen und Entwicklungsstadien der Tiere in der Masse übertragen werden. Chemische Behandlungen, wie z. B. FUDR, können in die Kultivierung Medien, um zu verhindern, dass die Produktion von Nachkommen durch Sperrung DNA-Replikation, und somit die Gameten Produktion und Ei-Entwicklung aufgelöst werden. Während wirksam, nach Entwicklungsstörungen Reifung, nicht die normalen Entwicklungsprozesse stören diese Methode angewendet werden, und dies bedeutet, dass es noch eine Voraussetzung um die Tiere vor seine Verwaltung3zu übertragen. Diese Methode beeinflusst auch mehrere zelluläre Signalwege, die spürbare Auswirkungen auf die Tiere wenn sie älter werden (z.B., eine Lebensdauerverlängerung oder eine veränderte proteostase) abhängig von der Sorte von C. Elegans verwendet5, 6,7,8,9,10. Flow Cytometry Methoden automatisch sortieren und individuelle C. Elegans aus einem Multi-well-Platte auf eine andere11übertragen. Während diese Methode sehr effektiv und effizient ist, ist Flow Cytometry Ausrüstung unerschwinglich teuer und für viele Forscher nicht zugänglich. Eine Alternative zur Übertragung von Tieren soll mutierten Modelle verwenden, die sind temperaturempfindlich, z. B. Fer-15 und Fem-1, die steril mit Temperatur Einstellung12geworden. Verwendung von mutierten Tieren in einigen Situationen nützlich ist, diese spezifische Stämme wachsen langsamer als Wildtyp Tiere und sie verlassen sich auf eine veränderte Genom, als schlechte Vertreter für alternde oder gesunde Würmer. Darüber hinaus das Vertrauen auf eine temperaturverschiebung induzieren Sterilität führt auch das Fehlen von einer statischen Umgebung, und Temperaturschwankungen leicht nachweislich Einfluss auf Gen Ausdrücke13,14, 15. Forschungsgruppen haben zuvor veröffentlichten Techniken beschreiben die Verwendung eines Netzes zum Filtern von C. Elegans nach Größe16. Jedoch konnten wir finden Vorarbeiten Tests für alle Änderungen an den allgemeinen Gesundheit Resultaten, die den Einsatz von solchen Filtern zugeordnet werden können.
So gibt es eine Notwendigkeit in C. Elegans Forschungskreisen eine kostengünstige, effiziente, schnelle und präzise Methode zur Übertragung von großen Anzahl von Tieren zwischen Kultur Platten. Wir haben eine verbesserte, zugängliche Stück Ausrüstung (benannt Caenorhabditis Sieb) und eine zugehörige Protokoll für seine Herstellung und Betrieb, die den Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaft C. Elegans entwickelt. Hierin, teilen wir das Design der Caenorhabditis Sieb und Methoden für den Einsatz, und wir zeigen, dass ihre Verwendung nicht die allgemeine Gesundheit oder alle Stress-Marker im Vergleich zu standard manuellen Kommissionierung und eine Behandlung mit den gängigen auswirkt, Einschränkung der Fruchtbarkeit chemische FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine etablierte Modellorganismus verwendet in einer Reihe von grundlegenden und biomedizinischen Forschung. Innerhalb der Nematoden Forschungsgemeinschaft ist eine Notwendigkeit für eine kostengünstige und effektive Möglichkeit, großer, Alter abgestimmt Populationen von C. Eleganszu. Hier präsentieren wir eine Methodik für die mechanisch sortieren und Reinigen von C. Elegans. Unser Ziel ist es, eine kostengünstige, effiziente, schnelle und einfache Verfahren um Tiere einheitliche Größen und Stufen für den Einsatz in Experimenten zu erhalten. Dieses Tool, das Sieb Caenorhabditis verwendet eine Custom-Built Deckel-System, die Gewinde auf gemeinsame konische Labor Röhren und C. Elegans anhand der Körpergröße sortiert. Wir zeigen auch, dass das Sieb Caenorhabditis Tiere effektiv aus einer Kultur Platte überträgt, zu einem anderen ermöglicht eine schnelle Sortierung, synchronisieren und Reinigung ohne Beeinträchtigung der Marker für Gesundheit, einschließlich der Motilität und Stress-induzierbaren gen-Reporter. Dieses allgemein zugänglicher und innovativer Tool ist eine schnelle, effiziente und nicht stressig-Option für die Aufrechterhaltung der Populationen von C. Elegans .

Die Caenorhabditis Sieb besteht aus 2 Schraubverschlüsse, Sicherung einer Fläche von gewebtem Nylon Monofilament Netz kleiner als der Körperdurchmesser von der gewünschten Entwicklungsalter, zum Extrahieren von live Populationen von Organismen mit einer einfachen waschen-Technik verwendet. Es legt auf standard konischen Rohren und nutzt das Sieb mechanisch Tiere Sortieren nach Körperdurchmesser, verlassen die gewünschten Tiere in der Röhre fertig für die weitere Wartung u...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K Aufrufe.  University of Alaska Fairbanks. Das aktuelle Protokoll beinhaltet eine Methodik für die Sortierung und Reinigung Alter abgestimmt Populationen von Caenorhabditis Elegans. Es verwendet eine einfache, kostengünstige, und effiziente maßgeschneiderte Werkzeug um eine große experimentelle Population von Nematoden für Forschung zu erhalten.

Serie: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Umwelt

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunologie und Infektion

Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community size structure responds to biotic and abiotic gradients, including anthropogenic perturbations across taxa and ecosystems. However, the manual measurement of small-bodied organisms such as benthic macroinvertebrates (e.g., &gt;500 &#181;m to a few centimeters long) is time-consuming. To expedite the estimation of community size structure, here, we developed a protocol to semi-automatically measure the individual body size of preserved river macroinvertebrates, which are one of the most commonly used bioindicators for assessing the ecological status of freshwater ecosystems. This protocol is adapted from an existing methodology developed to scan marine mesozooplankton with a scanning system designed for water samples. The protocol consists of three main steps: (1) scanning subsamples (fine and coarse sample size fractions) of river macroinvertebrates and processing the digitized images to individualize each detected object in each image; (2) creating, evaluating, and validating a learning set through artificial intelligence to semi-automatically separate the individual images of macroinvertebrates from detritus and artifacts in the scanned samples; and (3) depicting the size structure of the macroinvertebrate communities. In addition to the protocol, this work includes the calibration results and enumerates several challenges and recommendations to adapt the procedure to macroinvertebrate samples and to consider for further improvements. Overall, the results support the use of the presented scanning system for the automatic body size measurement of river macroinvertebrates and suggest that the depiction of their size spectrum is a valuable tool for the rapid bioassessment of freshwater ecosystems.

The article is based on the creation of an adapted protocol to scan, detect, sort, and identify digitized objects corresponding to benthic river macroinvertebrates using a semi-automatic imaging procedure. This procedure allows the acquisition of the individual size distributions and size metrics of a macroinvertebrate community in about 1 h.

Automatische Bildverarbeitung zur Bestimmung der Gemeinschaftsgrößenstruktur von Flussmakroinvertebraten

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Biotechnik

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Biologie

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Caenorhabditis Sieb: Ein Low-Tech-Instrument und Methodik für die Sortierung von kleiner vielzelliger Organismen

Zusammenfassung

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