Dieses Protokoll stellt die niedrigsten Kosten und die niedrigsten technischen Methoden für die Alterung in Meereseleganen dar. Ein einflussreicher Modellorganismus in der Alterungsbiologie. Der größte Vorteil dieser Methoden ist die einfache Implementierung mit kostengünstigen Geräten und Materialien.
Sie für jeden Forscher zugänglich zu machen, unabhängig von Erfahrung oder verfügbaren Finanzmitteln. Wie eine alte Alterungsstudie gibt es natürliche Variabilität in der Gesundheit innerhalb der Populationen. Daher ist es wichtig, dass Experimente an gesunden, gut gefütterten und eng synchronisierten Tieren durchgeführt werden.
Um eine Reißbehinderung zu gewährleisten, beginnen Sie mit der Vorbereitung von einem Liter Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM-Schneckenplatte. 2,5 Gramm Pepton, 3,0 Gramm Natriumchlorid und 20 Gramm Schnecke in einen Ein-Liter-Kolben mit einem Rührriegel geben und destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 970 Milliliter hinzufügen. Sterilisieren Sie die NGM-Schneckenlösung in einem Ein-Liter-Kolben mit einem Standardautoklaven oder Mediensterilisator.
Und lassen Sie die Lösung rühren, bis sie auf 60 bis 75 Grad Celsius abgekühlt ist. Während die Lösung abkühlt, erhitzen Sie ein Perlenbad auf 65 bis 70 Grad Celsius. Sobald die NGM-Schneckenlösung auf 60 bis 75 Grad Celsius abgekühlt ist.
Fügen Sie die flüssigen Additive hinzu und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang vollständig mischen. Anschließend tauchen Sie den Kolben in ein Perlenbad bei 65 bis 70 Grad Celsius, um zu verhindern, dass das Medium beim Eingießen in die Platte erstarrt. Neun bis 11 Milliliter der Lösung in jede 60-Milliliter-Platte pipettieren.
Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Pipette wieder in die erhitzte Lösung, um die Temperatur zu halten und zu verhindern, dass Medien in der Pipette erstarren. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Platten und lassen Sie NGM a-Platten über Nacht erstarren. Einmal verfestigt, verwenden Sie sie zum Aussäen von Platten mit Bakterien oder lagern Sie die Platten in verschlossenen Behältern für bis zu drei Monate bei vier Grad Celsius, um die Würmer durch Bleichen zu synchronisieren.
Sammeln Sie die Nematoden, indem Sie eine kleine Menge M9-Lösung auf eine Platte gießen, die die Würmer enthält, ohne die Petrischale zu überfüllen. Anschließend die Mnine-Lösung vorsichtig schwenken, um Würmer von den Bakterienrasen zu lösen. Als nächstes sammeln Sie adulte Gravidenwürmer in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen Pipette.
Vermeiden Sie es, die Schnecke mit der Pipettenspitze zu durchstechen. Die Tiere 30 Sekunden lang bei 1100 mal G zentrieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie fünf Milliliter der frisch zubereiteten Bleichlösung zum Wurmpellet hinzu und überprüfen Sie die Würmer alle paar Minuten unter einem Seziermikroskop zusammen mit intermittierendem kräftigem Schütteln, bis alle erwachsenen Wurmkörper aufgelöst sind und nur Eier in der Mischung übrig sind.
Als nächstes pelletieren Sie die Eier, indem Sie die Eierbleichmischung für 30 Sekunden bei 1100 mal G herunterdrehen und die Bleichlösung absaugen. Dann waschen Sie die pelletierten Eier, indem Sie bis zu 15 Milliliter M9-Lösung hinzufügen und das Röhrchen vier- oder fünfmal umkehren, um die Eier und die Lösung zu dispergieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut für 30 Sekunden bei 1100 mal G, um die Eier zu pelletieren und die M9-Lösung abzusaugen.
Führen Sie die Wäsche viermal durch, um Bleichmittel aus der Eimischung zu entfernen. Nach der vierten Waschzentrifusion saugen Sie die M9-Lösung von 100 Mikrolitern auf zwei Milliliter ab, abhängig von der Gesamtzahl der gebleichten Würmer. Schütteln Sie die Eier gründlich, um die Klumpen aufzubrechen, und stellen Sie sicher, dass die Eier in der M9-Lösung vollständig resuspendiert sind.
Alternativ können Tiere für eine engere zeitliche Synchronisation eins gehalten werden, indem 10 bis 12 Milliliter M9-Lösung in einem 15-Milliliter-Chronikröhrchen zum Eipellet gegeben werden. Lassen Sie die Würmer bis zu 24 Stunden in einem Rotator bei 20 Grad Celsius drehen. Um das Ei oder L anzunähern, pipette man vier Mikroliter der Eimischung auf eine mit Bakterien sitzende NGM-Platte.
Dann zählen und berechnen Sie die vorhandenen Eier pro Mikroliter Medien. Wiederholen Sie die Zählung drei- oder viermal, um die Näherung zu verbessern, basierend auf der Näherungsplatte, der entsprechenden Anzahl von Eiern oder L eins festgenommenen Tieren auf der NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien ihrer Wahl ausgesät ist. Zur Messung des Bewegungsverhaltens der Würmer mittels Thrashing.
Bewegen Sie eine kleine Anzahl von adulten Würmern des ersten Tages von einer NGM-Schneckenplatte auf 10 bis 20 Mikroliter M9-Lösung unter einem Sezierfernrohr. Konzentrieren Sie sich dann auf jeweils einen Wurm und zählen Sie, wie oft die Probe in 15 Sekunden von einer konkaven zu einer konvexen Bildung wechselt. Verwenden Sie einen Handzähler und einen Timer und wiederholen Sie den Vorgang für 10 bis 15 Würmer.
Altern Sie die Würmer auf das gewünschte Alter und wiederholen Sie die Prügelmessungen in allen gewünschten Altersstufen. Wie visualisiert, schlagen ältere Würmer mit deutlich langsameren Geschwindigkeiten. Für Mengen- und Fruchtbarkeitsmessungen.
Bei 10 bis 15 Caenorhabditis elegans-Würmern wählen Sie L vier Würmer in eine separate NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien Ihrer Wahl gesät ist. Lassen Sie die Tiere über Nacht bei 20 Grad Celsius wachsen und stellen Sie sicher, dass eine neu ausgesäte Charge Teller für den nächsten Tag bereit ist. Um die Menge der von Caenorhabditis elegans gelegten Eier zu messen, übertragen Sie die erwachsenen Würmer alle 12 bis 24 Stunden für sieben bis acht Tage oder bis die Eier nicht mehr sichtbar sind, in eine frische NGM-Schneckenklinge, die mit diesen geplünderten Bakterien besät ist, und zählen Sie die Anzahl der Eier, die auf die Teller gelegt werden.
Um die Brutgröße von Caenorhabditis elegans zu messen Übertragen Sie die erwachsenen Würmer alle 12 bis 24 Stunden oder sieben bis acht Tage oder bis die Nachkommen nicht mehr sichtbar sind, auf eine frische NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien besät ist. Halten Sie alle Teller mit Eiern bei 20 Grad Celsius. Zwei Tage nach der Übertragung von Würmern.
Zählen Sie die entwickelten Nachkommen auf dem Teller. Zählen Sie alle lebenden und sich entwickelnden Würmer im L-Vier-Stadium oder früher, um sicherzustellen, dass die F-Zwei-Generation die Ergebnisse nicht verwirrt. Entfernen Sie alle Würmer von der Platte, während sie gezählt werden.
Bewahren Sie die Platten für weitere ein bis zwei Tage auf, bevor Sie sie erneut ritzen, um sicherzustellen, dass Tiere mit verzögertem Schlüpfen oder Entwicklung nicht übersehen werden. Die Wirkung der Sterilisationsmethode auf die Lebensdauer der Wildtyp-N2-Nematoden zeigte, dass die Veränderungen in der Lebensdauer der auf den NGM-Schneckenplatten gezüchteten Würmer denen der auf den NGM-Schneckenschneckenplatten gezüchteten Würmer oder der glp vier BN2-mutierten Tiere, die auf den NGM-Schneckenplatten gezüchtet wurden, ähnlich waren. Das kurzlebige HSF-Ein-Knockdown-Tier zeigte eine signifikante Verringerung der Lebensdauer für alle Bedingungen.
Eine signifikante Abnahme der Anzahl der gelegten Eier und der Brutgröße wurde bei den HSF-Überexpressionstieren im Vergleich zu den Wildtypkontrollen festgestellt. Einige HSF-Tiere zeigten volle Sterilität, was darauf hindeutet, dass die reproduktive Gesundheit umgekehrt mit der Langlebigkeit korreliert werden kann. Die Prügelrate bot eine zuverlässige Methode zur Messung der Gesundheit während des Alterns, gemessen an einer signifikanten Abnahme der Prügel bei alten Tieren im Vergleich zu den jungen.
Survival to Stress sind zuverlässige Assays zur Messung der Gesundheit des Organismus, Tunicamycin, das Retikulum-Stress verursacht, führte zu einer reduzierten Lebensdauer unabhängig von der Konzentration im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Die hohen Paraquat-Konzentrationen verkürzten die Lebensdauer signifikant, während niedrige Paraquat-Konzentrationen die Lebensdauer aufgrund der hormetischen Wirkung erhöhten. In den Thermotoleranz-Assays erhöhte die Überexpression von HSF die Thermotoleranz bei 37 Grad Celsius Für alle Lebensdauer- und Alterungsexperimente.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sterilisationstechniken eine pleiotrope Wirkung auf die Gesundheit des Organismus haben können, was sich auf die Ergebnisse auswirkt. Es gibt viele zusätzliche und komplementäre Ansätze zur Messung der Gesundheitsspanne, wenn Ausrüstung und Infrastruktur verfügbar sind, einschließlich Messungen der Transkription, Translationsproteinaggregation, Organelle, Morphologie und Stoffwechselfunktionen.
