Name: measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates at JoVE.com

Wir erkennen die Caenorhabditis Genetics Center for C. elegans-Stämme. Finanzielle Unterstützung durch die Terry Fox Research Institute bereitgestellt. Wir unterstützen EP aus der Rolande und Marcel Gosselin Graduiertenstipendium und der CIHR / FRSQ Ausbildungsförderung in der Krebsforschung FRN53888 der McGill Integrated Cancer Research Training Program gewährt erkennen auch.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Herstellung von Medien für C. elegans Wachstum (in diesem Fall, Tiere Wildtyp und FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere). <ol><li> Bereiten Geändert Youngren nur Bactopepton (MYOB) Trockenmischung, die 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris-Base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl und 0,08 g Cholesterin. Gut mischen mit Schütteln. Anmerkung: Diese Mischung ist ausreichend, um 10 l MYOB Medium herzustellen. HINWEIS: normalem Wachstumsmedium (NGM) Platten könnte statt MYOB Platten 27 verwendet werden. Jedoch sollte die gleiche Art von Platten für gültige Vergleiche zwischen Stämmen und zwischen unabhängigen wiederholt verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir nur MYOB Platten. </li><li> Bereiten Sie 1 l MYOB Medium durch Zugabe von 6 g MYOB Trockenmischung, 17 g Agar und auf 1 L mit H 2 O und Autoklav für 45 Minuten bei 122 ° C. Platten gießen und lassen bei Raumtemperatur trocken für 2 Tage. </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken impfen 100 ml cultuWieder LB-Brühe-Medium mit E. coli OP50 Bakterien und wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Seed MYOB Platten mit E. coli OP50 Bakterien. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 48 Stunden wachsen. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Gen-Downregulation mit RNAi <ol><li> Bereiten MYOB RNAi-Zuführung Platten. Gehen Sie wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2. Nach dem Autoklavieren Das Medium auf etwa 55 ° C abkühlen gelassen und mit 1 ml 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 1 ml 100 mM Ampicillin. </li><li> Streak E. HT115 coli Bakterien, die mit einem Plasmid, das entweder Steuerung EV oder FLCN-1 spezifische RNAi auf Ampicillin (50 ug / ml) / Tetracyclin (15 ug / ml) Agarplatten drückt umgewandelt. Kultur wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Wählen Kolonien und impfen E. coli HT115 Bakterien mit einem Plasmid, das entweder Steuer EV oder FLCN-1 spezifische RNAi und wachsen Kultur in LB / Ampicillin (50 ug / ml) mittel- und O / N bei 37 &amp; # drückt transformiert176; C. </li><li> Samen Platten mit E. coli HT115 EV Bakterien oder HT115 FLCN-1 RNAi Bakterien. Hinweis: Bewahren Sie Platten 48 Stunden bei Raumtemperatur vor der Verwendung. Wenn RNAi durch Einspeisen in Wirk, andere Verfahren der Abgabe der ds-RNA 28. </li></ol></li><li> Induziert oxidativen Stress mit Paraquat (PQ): <ol><li> Vorbereitung M9 Puffer durch Mischen von 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl und 0,25 g MgSO 4 · 7 H 2 O. Bringen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser. Autoklaven-Lösung für 45 min bei 122 ° C und zu speichern Flaschen bei RT. </li><li> Am Tag des Assays, bereiten Sie die M9 / PQ-haltigen Lösung. Für dieses Protokoll verwenden 100 mM PQ (0,1028 g PQ in 4 ml M9-Puffer füllt ein ganzes 96-Well-Platten mit 40 ul M9 / PQ pro Vertiefung). ACHTUNG: PQ ist eine gefährliche und hochgiftige Verbindung. Griff nach entsprechenden Richtlinien. HINWEIS: Beim ersten Ausführen eine neue sZug oder ein neuer Zustand, ist es empfehlenswert, um das Überleben in steigenden Konzentrationen von PQ um das beste Konzentration, um die Tiere in 7-10 h zu töten verwenden bestimmen, zu untersuchen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Age-synchronisiert L4 Bevölkerung <ol><li> Transfer 20 gravid Erwachsenen Hermaphroditen auf eine frische Platte mit MYOB E. ausgesät coli OP50 Bakterien. Vorbereitung mehrere Platten auf der Basis der Anzahl der Würmer bei den Assay benötigt. </li><li> Lassen Sie sie Eier für 6 Stunden und dann mit einem Platindraht Wurm Pick entfernen Sie die Mütter legen. Überprüfen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um die Anzahl der gelegten Eier zu bewerten. </li><li> Lassen Sie die Eier schlüpfen und wachsen bei 20 ° C für 48 Stunden. Zu dieser Zeit sind die Tiere in einem späten L4 / junger Erwachsener Bühne. Wählen gleichen Stufe Tiere und Transfer zum PQ Lösung haltigen Brunnen. Hinweis: Da 48-stündiger Inkubation nur auf Mutanten, die ähnlich zu den Wildtyp-Tieren wachsen, ist es wichtig, zu überwachen EntwicklungsRate der neu getesteten Mutanten, um sicherzustellen, es erfüllt die Entwicklungsrate Wildtyp, sonst sollten andere Zeitleisten verwendet werden. </li><li> Alternativ können Sie Synchronisationstechniken. Generieren synchronisiert Bevölkerung von L1-Larven Würmer mit Hypochlorit-Lösung (25 ml Wasser, 125 ml von 5,25% Natriumhypochlorid, 50 ml von 4 M NaOH; wickeln Flasche mit Aluminiumfolie vor Licht zu isolieren). Für diesen Test ist es nicht empfehlenswert, da intensive Bleich könnte das Verhalten der Tiere während des Assays beeinflussen. VORSICHT: Gehen Sie Hypochlorit-Lösung nach den Richtlinien. HINWEIS: Bei der Verwendung von RNAi, um nach unten zu regulieren das Gen von Interesse, die Hermaphroditen zu synchronisieren, wie in Kapitel 2 beschrieben, mit der Ausnahme von der Übertragung von Müttern auf RNAi-Platten mit den spezifischen RNAi Bakterien geimpft. Wenn der Zuschlags mit der RNAi schwach ist, wird Fütterung für mehrere Generationen empfohlen. </li></ol> 3. Durchführung der oxidativen Stressresistenz Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Pipette 40 ul der 100 mM PQ-Lösung (frisch zubereitet) auf jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Wells als repliziert jeder Bedingung (Behandlung, mutant, etc.). Unter Verwendung einer Platindraht-Wurm Pick, übertragen 5-8 L4-Larven Tiere jeden gut, die die Startzeit und die Endzeit. </li><li> Beim Start eine weitere Bedingung, beachten Sie die Startzeit und die Endzeit. Legen Sie die Platte bei 20 ° C in der Inkubationszeit zwischen toten Tieren eine Stunde später die Übertragung der Würmer und Scoring von der Startzeit. </li><li> Verwenden des Binokular, zählen Überlebens jeden hr. Die Platte Schütteln Sie vor dem Start zu zählen. Geben Sie Würmer, die sich nicht bewegen, auch nach dem Absetzen einer Licht von hoher Intensität, wie tote Tiere. Auch die Anzahl der Tiere am Leben. HINWEIS: Mit Blick auf Schneckenform, Schwänze und Kopfbewegung bei hoher Vergrößerung, um festzustellen, tote Würmer lebendig. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt jede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Bestimmung der Überlebensprozent zu jedem Zeitpunkt <ol><li> Berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere pro Bedingung, indem Sie die Gesamtzahl der Tiere, um jedes über gut. Ignorieren Sie die Tiere, die beschädigt sind oder bei der Übertragung getötet. </li><li> Für jeden Zeitpunkt berechnen die Gesamtzahl der toten Tieren pro Bedingung (Summe der toten Tiere in den 12 Vertiefungen). Für jeden Zeitpunkt berechnen Prozentsatz des Todes (Anzahl der toten Tiere dividiert durch die Gesamtzahl der Tiere und multipliziert mit 100) und den Prozentsatz des Überlebens (100 minus Prozent Tod). </li><li> Wiederholen Sie diesen Test mindestens 3 unabhängigen Zeiten. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

C. elegans ist ein attraktives Modellorganismus genetisch oxidative Stressresistenz in vivo zu untersuchen, da es leicht gezüchtet werden können, und führt zu einer Vielzahl genetisch identischer Nachkommenschaft schnell. Mehrere Methoden zur oxidativen Stress Widerstand zu messen, wurden zuvor beschrieben und sie sind auf die Ergänzung von Kulturplatten mit verschiedenen ROS Quellen wie PQ, Rotenon, H 2 O 2 und Juglon 25,26,29-32 basiert. Hier beschreiben wir ein P...

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Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

In Eukaryoten ist die oxidative Phosphorylierung, die sich in der Elektronentransportkette der Mitochondrien der Haupttreiber der Energieproduktion in Form von ATP. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind ein natürliches Nebenprodukt des Prozesses. Trotz ihrer wichtigen Rolle als Signalmoleküle, können übermäßige ROS auf DNA-Schäden, Protein-Carbonylierung und Lipidoxidation führen. Ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und Entgiftung verursacht oxidativen Stress, was zu Energiemangel, Zellschäden führt, und löst den Zelltod 1,2. Oxidativer Stress trägt zur Alterung und auf die Entwicklung von vielen lebensbedrohlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf- und neurodegenerative Erkrankungen 3-9. Zellen enzymatischen und nicht-enzymatischen Abwehrstrategien entwickelt, um die ordnungsgemäße ROS Niveau zu halten und ihre Bestandteile vor oxidativen Schäden schützen 1,2. Superoxid-Dismutase (SOD) Enzyme wirken Erste convert Superoxid zu H 2 O 2, die später in Wasser umgewandelt wird von Katalase oder Peroxidase-Enzyme. Nicht enzymatischen Abwehrstrategien beinhalten meist Moleküle, die schneller mit ROS im Vergleich zu zellulären Makromolekülen, zum Schutz wesentlicher Zellkomponenten reagieren. Trotz der schützende Rolle von ROS Entgiftungsenzyme, einige ROS-Moleküle entweichen die antioxidativen Abwehrmechanismen und führen zu oxidativen Schäden. Erkennung, Reparatur und Abbau der beschädigten zellulären Komponenten sind wesentliche Verteidigungsstrategien während oxidativem Stress 1,2. Signalwege in Stressresistenz und speziell oxidativem Stress beteiligt sind hoch evolutionär konservierte 10,11. Im Gegensatz zu Zellkulturexperimenten, wo organismal Bedingungen nur teilweise wiedergegeben werden, die Untersuchung von oxidativem Stress in Modellorganismen 12,13 hat eine große Bedeutung. C. elegans ist ein freilebenden Nematoden, die einfach und kostengünstig sein kann culnissen auf einem Bakterienrasen auf Agar-Medien. Es ist klein (ca. 1 mm in der Länge) und in der Regel wächst als selbstDünge Zwitter, die genetische Manipulationen erleichtert. Es hat eine schnelle Lebenszyklus und eine hohe Fortpflanzungsfähigkeit, die rund 300 Nachkommen pro Generation, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug, um groß angelegte genetische Screens 14 durchzuführen. C. elegans Genom vollständig sequenziert und 40-50% der Gene vorhergesagt werden, um Homologe des humanen krankheitsassoziierten Genen 15-18 sein. Der Knockdown von Genen von Interesse unter Verwendung von RNAi ist eine schnelle und einfache in C. elegans. Gene Herunterregulierung könnte durch Füttern von Tieren der E. erreicht werden coli-Bakterien, die ein Plasmid, das das doppelsträngige RNA, die die mRNA von Interesse 19 zielt exprimieren beherbergen. Daher hat die Bestimmung der Genfunktion mit Groß RNAi-Screens großen Einfluss auf das Verständnis der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs 20,21. Studium der oxidative Stressresistenz in C. elegans haben zur Identifizierung von konservierten Mechanismen der Resistenz gegen oxidative Belastung 13,22 geführt. Einige Wege identifiziert normale Wege, die Langlebigkeit und Beständigkeit zu modulieren anderen Belastungen als auch, wie Hypoxie, Wärme und osmotischen Stress. Diese Wege sind die Insulin-Signal, TOR-Signalisierung und Autophagie. Weitere wichtige Signalwege beinhalten Entgiftung von ROS wie Superoxid-Dismutase Enzyme und Enzyme Katalase, oder in Schaden zu reparieren, wie Hitzeschock und Chaperon-Proteine ​​11,13,22. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativem Stress von C. bestimmen elegans in Flüssigkeit. Wir verwendeten FLCN-1 (ok975) und Wildtyp-Tieren, das Protokoll zu zeigen, da wir zuvor in C gezeigt, eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress bei Verlust der FLCN-1 (ok975) elegans 23. Wir haben auch gezeigt, dass dieser Widerstand hängtauf AMPK und Autophagie, einen Signalisierungs Achse, die zelluläre Bioenergetik verbessert und fördert die Stressresistenz 23. PQ ist eine oxidative Stressfaktor, der mit der Elektronentransportkette an reaktiven Sauerstoffspezies produzieren 24 stört. Das gleiche Assay könnte angepasst werden und andere ROS Quellen oder ROS erzeugende Verbindungen könnten als H 2 O 2 und Rotenon verwendet werden, so. Ähnliche Tests wurden auf Platten, wo niedrige Konzentrationen von PQ verwendet 25,26 entwickelt. Der Vorteil dieses Tests ist, dass es sehr schnell ist, und die Ergebnisse können in einem Tag erreicht werden. Zusätzlich ist das Gesamtvolumen der Flüssigkeit verwendet, um den oxidativen Stress Resistenzassay in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt gering, verglichen mit der zur Bestimmung PQ-enthaltenden Platten herzustellen Volumens. Daher ist die Menge des verwendeten PQ im flüssigen Assay gering ist, was den Assay macht preiswerte und begrenzt die Erzeugung von Giftmüll. , Grenzen dieses Tests im Vergleich zu Plattentests sind jedoch die lack von Nahrungsmitteln im flüssigen Assay und der geringeren Konzentration an Sauerstoff in flüssiger, im Vergleich zu Luft. Dies sind wichtige Faktoren, die in einigen Fällen die Ergebnisse beeinflussen. Daher bestätigt die Reproduzierbarkeit mit anderen Methoden von oxidativem Stress Widerstand wird empfohlen, die Ergebnisse in diesem Test erhalten unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

Oxidativer Stress, der die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies ist, ist ein wesentlicher Faktor, um chronische Humanerkrankungen, kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes, Altern und Krebs. Daher ist es wichtig, oxidativen Stress nicht nur in Zellsystemen als auch mit ganzen Organismen zu studieren. C. elegans ist eine attraktive Modellorganismus, um die Genetik von oxidativem Stress Signaltransduktionswege, die sehr evolutionär konserviert sind zu studieren. Hier stellen wir ein Protokoll, um oxidativen Stress Widerstand in C messen elegans in Flüssigkeit. Kurz gesagt, ROS-induzierenden Reagenzien wie Paraquat (PQ) und H 2 O 2 in M9-Puffer und Lösungen werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aliquotiert. Synchronisiert L4 / jungen Erwachsenen C. elegans Tiere werden zu den Vertiefungen transferiert (5-8 Tiere / Vertiefung) und das Überleben wird gemessenjede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot. Bei der Durchführung eines oxidativen Stressresistenz-Test unter Verwendung einer niedrigen Konzentration von Stressfaktoren in Platten, Alterung könnte das Verhalten der Tiere auf oxidativen Stress, was zu einer falschen Interpretation der Daten führen könnten, zu beeinflussen. In dem hier beschriebenen Assay Dieses Problem ist jedoch nicht wahrscheinlich, da nur L4 / junge Tiere verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll kostengünstig und Ergebnisse werden in einem Tag, die diese Technik attraktive für genetische Screens rendert erhalten. Insgesamt wird dies dazu beitragen, um oxidativen Stress Signalübertragungswege, die in bessere Charakterisierung des oxidativen Stress-assoziierten menschlichen Erkrankungen übersetzt werden konnte verstehen.

Vergleicht man Wildtyp C. elegans zu FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere Hier haben wir 100 mM PQ, um den Widerstand von Wildtyp-C zu bestimmen elegans Tieren im Vergleich zu FLCN-1 (ok975) von dem gezeigt wurde auf oxidativen Stress, Hitze und Anoxie 23 zu widerstehen. Nach 4 Stunden der Behandlung, 48,3% des Wildtyp-überlebt, im Vergleich zu 77,8% Überlebensrate in FLCN-1 (ok975) Tiere. Wie erwartet, FLCN-1 (ok975) muti...

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Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K Aufrufe.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

Serie: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Forschung

Biochemie

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Umwelt

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genetik

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Entwicklungsbiologie

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biologie

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Überlebenstest: Ein Kurzzeittoxizitätstest

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat

Zusammenfassung

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