Dieses Protokoll ist wichtig, weil es den Knockdown und die Überexpression von Genen in einem sich entwickelnden Fisch und die Quantifizierung dieser nachgelagerten Effekte auf Blutzellen ermöglicht. Dieses Protokoll ist schnell, einfach durchzuführen, wirtschaftlich und einfach zu automatisieren mit Demzugriff auf die richtige Instrumentierung. Demonstriert wird dieses Verfahren von Kristen Rueb, einer Forscherin im Labor.
Beginnen Sie mit der Übertragung zwischen fünf und 200, 48 Stunden nach der Befruchtung Embryonen in eine Kunststoff 10 Zentimeter Petrischale. Neigen Sie die Schale so, dass der Embryo an den unteren Rand sinken, und entfernen Sie so viel E3 Medium wie möglich aus der Schale. Dann 500 Mikroliter Dechorionation Protease zu den Embryonen hinzufügen.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur alle Embryonen wieder an den unteren Rand der Platte kippen und sanft auf die Seite der Schale tippen, so dass die Embryonen sanft an der Unterseite der Platte reiben können, um ihre Krähen vollständig zu entfernen. Mit einer Squeeze-Flasche etwa 20 Milliliter E3 Medium hinzufügen, um die Protease zu verdünnen, und lassen Sie die Embryonen absetzen. Dann dekantieren Sie das Medium, und spülen Sie die Embryonen dreimal mit frischem Medium, wie gerade gezeigt, um alle Spuren der Protease zu entfernen.
Um die Embryonen auf die Dissoziation vorzubereiten, verwenden Sie eine P1000 Pipette, um fünf bis zehn Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu übertragen und das übertragene E3-Medium anzusaugen. Dann fügen Sie einen Milliliter 10 Millimolar DTT in E3 Medium zu den embryonalen Zebrafischen, und legen Sie das Mikrozentrifugenrohr in einer horizontalen Position für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Schleimbeschichtung zu entfernen. Für die Embryodissoziation die von DTT behandelten Embryonen dreimal mit einem Milliliter DPBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium pro Wäsche, waschen.
Vor zugabe von 500 Mikroliter dPBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium, und fünf Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter, Dissoziation Protease. Dann inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius auf einem horizontalen Orbital-Shaker bei 185 Umdrehungen pro Minute für 60 Minuten. Achten Sie darauf, regelmäßig auf die Embryonen zu überprüfen, so dass Sie sie nicht überverdauen.
Wenn eine nicht vollständig homogene Probe mit etwas festem Gewebe beobachtet werden kann, trituieren Sie die Embryonen mit einer P1000 Pipette, bis die Probe vollständig getrennt ist. Um die dissoziierten Zebrafisch-Embryonalzellen auf die Durchflusszytometrie vorzubereiten, übertragen Sie die gesamte Zellprobe auf das obere Reservoir eines fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenrohrs mit einer 35 Mikrometer-Zellsiebkappe. Spülen Sie die Kappe mit vier Millilitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium und pellet die Zellen durch Zentrifugation.
Dann setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS ohne Kalzium und Magnesium pro Tube wieder aus. Für die zytometrische Analyse der embryonalen Zebrafische wirbeln die Zellsuspensionen sanft, bevor Sie jeder Röhre eine Verdünnung roter toter Zellen hinzufügen. Innerhalb von 30 Minuten nach dem Auftragen des toten Zellflecks, leeren Sie den Abfallbehälter, füllen Sie den Manteltank mit der entsprechenden Lösung, und starten Sie das Fluidsystem des Durchflusszytometers.
Zeichnen Sie in der Analysesoftware fünf Diagramme, und legen Sie das erste Diagramm fest, um vorwärts versus seitenstreuend zu messen. Legen Sie die Vorwärtsstreuung auf linear und die Seitenstreuung auf logarithmisch fest. Legen Sie das zweite Diagramm fest, um die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Streubreite nach vorne zu messen, und das dritte Diagramm, um die Streuhöhe im Vergleich zur Seitenstreuungsbreite zu messen.
Legen Sie das vierte Diagramm fest, um den roten Fleck für tote Zellen auf der x-Achse und die Seitenstreuung auf der y-Achse zu messen, um die Diskriminierung von Leben von toten Zellen zu ermöglichen. Das fünfte Diagramm sollte so festgelegt werden, dass das Fluorophor der Wahl gemessen wird. Wenn alle Diagramme festgelegt sind, laden Sie die Probe auf das Zytometer, und reduzieren Sie den Durchfluss, damit die Zellen nicht schnell auslaufen.
Passen Sie die Einstellungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung so an, dass der Großteil der Zellpopulation deutlich beobachtet werden kann, und zeichnen Sie ein Tor um die Zellpopulation. Beschriften Sie diese Gate-Zellen. Mit dem zweiten Punkt-Plot auf den Zellen, Tor auf Vorwärts-Streuung und die Seite Streuner Singlets, um Doublets auszuschließen.
Passen Sie im vierten Diagramm die Einstellungen für rote tote Zellen so an, dass eine deutlich negative Population vorhanden ist. Zeichnen Sie ein Tor um diese Zellen und beschriften Sie dieses Tor als lebende Zellen. Im fünften Plot, Tor auf den lebenden Zellen und zeichnen Sie ein Tor um die positiven Zellen, dann laufen jede Probe sammeln mindestens 25 000 Live-Zell-Ereignisse.
Wenn alle Proben analysiert wurden, folgen Sie dem Abschaltvorgang, um die Fluide auszuschalten, den Manteltank nachzufüllen und den Abfallbehälter zu entleeren. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP-positiven roten Blutkörperchen aus jeder embryonalen Zebrafischprobe kann der Durchschnitt aller Kontrollgruppen berechnet werden. In der Regel wird der Durchschnitt als eins festgelegt, und alle Prozentsätze werden von diesem Referenzpunkt berechnet.
In dieser repräsentativen Analyse wurde festgestellt, dass die Reduzierung der ISM1-Transkription mit einem spezifischen Morpholino die Anzahl der GFP-positiven roten Blutkörperchen innerhalb von 48 Stunden nach der Befruchtung Embryonen reduzieren. Durch die Rettung dieser Reduktion des ISM1-Morpholinospiegels mit exogener mRNA wird die Anzahl der roten Blutkörperchen wieder normalisiert. Die richtige Verdauung der Proben ist entscheidend.
Wenn Sie über- oder unter-verdauen, erhalten Sie nicht die richtigen Ergebnisse. Wenn ein Faxgerät zur Verfügung steht, können Forscher die Blutzellen sammeln, indem sie nach In-vitro-Kultur, RNA-Sequenzierung und quantitativer RT-PCR sortieren.
