Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health NIDDK Zuschuss (K01DK092320) und Anschubfinanzierung von der Abteilung für Pädiatrie an der University of Texas Medical School McGovern unterstützt.

(: HSC-AWC-13-135-Protokoll #) Das folgende Protokoll wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, das dient als Institutional Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Identifizierung und Auswahl von Blastomeren für Injektionszwecke Nieren-bezogenen <ol><li> Vor der Embryonen zu erzeugen, verwenden Sie die normale Tabelle der Xenopus - Entwicklung 21 , um die Ausrichtung der ersten Zellteilungen im Embryo zu verstehen. Alternativ Zugriffsdiagramme der frühen Entwicklungsstadien von Xenopus auf Xenbase 11. </li><li> Zugriff auf die interaktive Xenopus Zellschicksal Karten auf Xenbase 11 zu wählen , welche Blastomere für Mikroinjektionsausgerichtet sein. </li><li> Beachten Sie, dass die einzelne Zelle Embryo eine dunkel pigmentierte Tier Pol und einen vegetativen Pol, der weiß und yolky ist. Beachten Sie, dass eine Schutzmembran, wie die Dotter e bekanntnvelope, deckt den Embryo. </li><li> Beachten Sie, dass die erste Spaltungs typischerweise zwischen den linken und rechten Seite des Embryos erfolgt. Diese Zellen tragen gleichermaßen zur pronephric Linie. </li><li> Man beachte, dass die zweite Spaltungs die dorsale und ventrale Hälften des Embryos aufteilt, mit einem 4-Zellen-Embryo führt. Die dorsale Zellen sind kleiner und haben weniger Pigment als die ventralen Zellen (2A und 3A). <ol><li> Identifizieren der ventralen Blastomeren (V, die große, dunkle Zellen) auf der linken und rechten Seite, die mehr auf die Entwicklung von Nieren als der dorsal beitragen (D; kleine, leichte Zellen) Blastomeren (2A). </li><li> Wenn in ein 4-Zellen - Embryo eingespritzt wird , injizieren die linke ventrale Blastomere der linken Niere (3A und Abschnitt 3) zu richten. </li></ol></li><li> Die dritte Spaltungs halbiert den animalen und vegetativen Seiten, was zu einer Acht-Zellen-Embryos. An diesem Punkt gibt es vier Tier Blastomeren [linke und rechte ventrale(V1) und dorsal (D1)] und vier vegetabile Blastomeren [linke und rechte ventrale (V2) und dorsal (D2)] (2B und 3B). <ol><li> Suchen Sie die ventralen, pflanzliche Blastomeren (V2). Diese Blastomeren tragen mehr zur Entwicklung von Nieren alle anderen Zellen in dieser Phase (2B). Um die linke Niere eines 8-Zellen - Embryo Ziel, spritzen in die linke V2 Blastomere (3B und Abschnitt 3). </li></ol></li><li> Beachten Sie, dass die vierte und fünfte cleavages die tierischen und pflanzlichen Blastomeren bisect. Zwei Nachkommen werden von jedem Blastomere erzeugt, was zu einer 16-Zellen-Embryo. Die Zellen werden nach ihrem Vorgänger benannt. Beispielsweise gibt der V2 Blastomere von der 8-Zellen - Stadium zur V2.1 und V2.2 Nachkommen im 16-Zell - Stadium (Abbildung 2C). Die Zelle V2.2 an der 16-Zell-Stadium stellt die Mehrheit der beitragenden Zellen zu der Entwicklungs Niere. </li><li> Die dargestellten sechsten und siebten cleavages resultieren in einem 32-Zellen-embryO. Auch hier sind zwei Nachkommen aus jeder Blastomere erzeugt, die im Anschluss an ihre Vorgänger benannt sind. Zum Beispiel gibt der Blastomere V2.2 aus dem 16-Zellen-Stadium zur V2.2.1 und V2.2.2 im 32-Zell-Stadium. Es gibt eine Alternative Benennungssystem im 32-Zell-Stadium, in dem Zellen in vier Reihen als A, B bezeichnet sind, C und D (von Tier zu vegetabile) und in vier Spalten 1, 2, 3, und 4 ( von dorsal nach ventral). Somit ist die V2.2.2 Blastomere, die am meisten zu den Entwicklungs pronephros trägt, wird C3 unter dieser alternativen Benennungssystem (2D) genannt. </li></ol> 2. Herstellung von Embryonen <ol><li> Vorbereitung 50 ml Dejelly Lösung (2% Cystein, NaOH auf pH 8,0). </li><li> Isolieren Sie beide Hoden von einem einzigen männlichen Frosch nach Standardprotokollen 14. Legen Sie die Hoden in einer 60 mm Petrischale gefüllt mit 10 ml Testes - Storage - Lösung (1x Marc-modifiziertem Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% Rinderserumalbumin, 50 ug / ml Gentamycin). Lagern Sie die Hoden bei 4 ° C. Hinweis: Testes kann für etwa 7 gespeichert werden - 10 Tage bei 4 ° C, aber Befruchtungseffizienz abnimmt, je länger die Hoden gespeichert wurden. </li><li> Drücken Sie einen weiblichen Froscheier zu erhalten , nach Standardprotokollen 14. Sammeln Sie die Eier in einer 100 mm Petrischale. Gießen Sie überschüssiges Wasser ab. </li><li> Schneiden Sie ¼ eines Hodens aus, während es in Testes-Storage-Lösung ist Zange und mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie das Stück Hoden in die Petrischale mit Eiern. Passen Sie die Größe des Abschnitts Hodens zu Konto für die Größe des Hodens verwendet, wie lange der Hoden gespeichert ist, und wie viele Eier sind befruchtet werden. Im Allgemeinen verwenden ¼ bis 1/3 eines frisch seziert Hoden ein Gelege zu befruchten. </li><li> Schneiden Sie den Hoden Teil in kleine Stücke mit einer Pinzette und eine Rasierklinge. Fügen Sie genug 0.3x MMR+ 30 mg / ml Gentamycin in die Petrischale um die Eier zu bedecken. Schwenken Sie die MMR in der Schale zu mischen. </li><li> Warten Sie ca. 30 Minuten für die Befruchtung bei Raumtemperatur zu nehmen. Beachten Sie, dass das Tier Hemisphäre (die pigmentierte Seite des Embryos) auf der Oberseite des Embryos auf wirksame Befruchtung sitzen. Entfernen Sie dann die MMR aus der Petrischale eine Transferpipette. Fügen Sie genug Dejelly Lösung in die Schale, die Embryonen zu decken. </li><li> In den nächsten paar Minuten, vorsichtig schwenken die intermittierend Gericht. Heftigem Schütteln der Schale zu diesem Zeitpunkt kann Achse Defekte verursachen. &#160; Die Gallerthülle auf den Embryonen wird sich auflösen, und die Embryonen werden während wirbeln in der Mitte der Schale versammeln. Sobald die Embryonen eng einander in der Mitte der Schale zu berühren, entfernen Sie die Dejelly Lösung mit einer Transferpipette. Lassen Sie keine Embryonen in der Dejelly Lösung für länger als 5 Minuten, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt. </li><li> Waschen Sie die dejellied Embryonen 3-5 mal in 0.3xMMR + 30 mg / ml Gentamycin durch vorsichtiges Gießen oder Abpipettieren des MMR und die Schale mit neuen MMR füllen. Nicht alle der MMR von der Schale zu entfernen, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt. </li><li> Entfernen Sie alle unbefruchteten Eiern oder Stücke von Hoden aus der Petrischale eine Transferpipette. </li><li> Inkubieren Embryonen zwischen 14 und 22 ° C. Hinweis: Die Embryonen bei niedrigeren Temperaturen gewachsen entwickeln langsamer als Embryonen bei höheren Temperaturen gewachsen. Zeitpunkt der Entwicklungsstadien auf Xenbase 22 zu finden. <ol><li> Um Platz aus ihrer Entwicklung, Platz Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in einer Petrischale gehalten bei 14 ° C, und die andere Hälfte der Embryonen in einer Petrischale gehalten bei 18 ° C. Dies ermöglicht zwei Sätze von Injektionen in 4-Zellen-oder 8-Zellen-Embryos aus einer einzigen Befruchtung. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Injektionslösungen und Mikroinjektion von Embry <ol><li> Bereiten Sie die Injektionslösung, die 0,01ng / nl membrangebundenen rot fluoreszierendes Protein (MEM-RFP) mRNA 9 , während sich die Embryonen im 4-Zellen - oder 8-Zell - Stadium entwickeln. Lagern Sie die Injektionslösung auf Eis, bis die Injektion bereit. </li><li> Legen Sie eine 7 &quot;Ersatz Glaskapillarrohrs in eine Nadel Abzieher, mit der Spitze des Ersatzröhre mit der Spitze der Nadel Abzieher Fall ausgerichtet ist. Stellen Sie die Hitze # 2-Wert bis 800 und der Pull-Wert auf 650. Drücken Sie die&quot; ziehen &quot;, um die Nadel zu ziehen. Dies erzeugt zwei Nadeln aus einer einzigen 7&quot; Glaskapillarrohrs. </li><li> Snip die Spitze einer Nadel gezogen mit einem Paar von Dumont Zange ab. Hinweis: Nach der Nadel ziehen, wird die Spitze dicht verschlossen und muss aufgeschnitten werden. Je näher an der Spitze der Nadel, die es geschnitten wird, je kleiner der Durchmesser der Nadelspitze ist. Obwohl der Durchmesser der Spitze nicht das Injektionsvolumen mit dem Mikroinjektionssystem hier verwendet beeinflussen, eine Spitze mit einem größeren Durchmesser ist wahrscheinlicher, den Embryo zu beschädigen. </li><li> Schieben Sie die micropipette Spannzange auf die Rückseite der Nadel. Als nächstes schieben Sie die große Loch O-Ring hinter der Spannzange der Nadel auf der Rückseite. </li><li> Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl mit einer 27-Gauge-Injektionsnadel verwenden, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen in der Nadel zu bekommen. </li><li> Schieben Sie die Nadel auf den Kolben der Mikroinjektors, die Nadel in das große Loch der weißen Plastikabstandhalter auf dem Kolben installiert Sitz. Der Kolben sollte einen kleinen O-Ring am nächsten zu dem Körper des Mikroinjektors, gefolgt von den weißen Abstandhalter, großes Loch O-Ring und Spannzange. Befestigen Sie die Nadel durch die Spannzange festziehen. Ziehen Sie vorsichtig an der Nadel, um sicherzustellen, dass es richtig gesichert ist. </li><li> Drücken und halten Sie die &quot;leere&quot; -Taste auf der Mikroinjektors Steuerbox, bis zwei Pieptöne sind. </li><li> Pipette 3 ul Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Legen Sie die Spitze der Nadel in die Perle der Injektionslösung auf dem Parafilm. Drücken und halten Sie die &quot;füllen&quot; -Taste auf der microinjector Kontrollkästchen, um die Injektionslösung in die Nadel zu ziehen. </li><li> Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit 500 Mikron Polyester ausgekleidet Netz mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin. Sorgfältig pipettieren 20-30 April-Zell-oder 8-Zellen-Embryonen in die Schale. </li><li> Verwendung einer Haarschleife 14, manipulieren die Embryonen so dass die Blastomere einzuspritzen ist die Nadel gegenüber . Zur Ausrichtung auf die linke Niere, richten Sie die Embryonen, so dass die linke ventrale Blastomeren von 4-Zellen-Embryonen oder links V2 Blastomeren von 8-Zellen-Embryonen, die Nadel stellen. </li><li> Einzuspritzen 10 nl der Injektionslösung in den ausgewählten Blastomere von jedem Embryo in der Schale. Hinweis: Das Gitter am Boden der Petrischale stabilisiert die Embryonen und verhindert, dass sie rollen, so dass sie für die Stabilisierung ohne die Verwendung eines Haarschleife injiziert werden. </li><li> Transfer Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte eingespritzt, die mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin gefüllt wurden. Inkubieren des injizierten Embryos bei 16 ° C für mindestens eine Stunde, um die injizierte Blastomere zu erlauben, zu heilen. </li><li> Übertragen Sie die geheilt Embryonen in die Vertiefungen einer neuen Kulturplatte, die mit 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin von Stufe 9 (vor der Gastrulation) gefüllt wurden. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen bei 14 bis 40 21 - 22 ° C , bis die Embryonen Stufe 38 erreichen. </li></ol> 4. Fixierung und Immunfärbung von Embryonen <ol><li> Vorbereitung 50 ml MOPS / EGTA / Magnesium sulfat / Formaldehyde Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (v / v) Formaldehyd]. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, setzen 10 - 20 Stufe 38 bis 40 Embryonen in einem Glasfläschchen. Fügen Sie 10 &amp; mgr; l 5% Benzocain in 100% igem Ethanol in das Fläschchen und invert Phiole zu mischen. Warten Sie 10 min, die Embryonen zu betäuben. </li><li> Entfernen Sie die MMR aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Wenn mehrere Ampullen gleichzeitig Verarbeitung können die Phiolen aufrecht in einer Platte mit 24 Vertiefungen Zellkultur gehalten werden. </li><li> Mit einem Glasrohrtte, füllen Sie das Fläschchen mit MEMFA. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die MEMFA aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Füllen Sie das Fläschchen mit 100% Methanol. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal, und speichern Sie die Embryonen in 100% Methanol über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Vorbereitung 1x Phosphate Buffered Saline-Rinderserumalbumin-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum mit einem 1: 5 - Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörper 4A6 (zu etikettieren die Membranen der Zwischen, distalen und Verbindungs ​​Tubuli 20), eine 01.30 Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörpers 3G8 (zu Etikett Lumen der proximalen Tubuli 20) und einer 1: 250 Verdünnung von Kaninchen - polyklonalen Antikörper RFP (um die MEM-RFP - Tracer - Label). Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die secondary-Antikörper-Lösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum, 1: 500 Alexa 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (Stammkonzentration 2 mg / ml; beschriften 4A6 und 3G8) und 1: 500 Alexa 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Lager Konzentration 2 mg / ml; die MEM-RFP-Tracer zur Markierung). Lagerung bei 4 ° C, für den Schlauch in Folie vor Licht zu schützen. </li><li> Alternativ sammeln die primären und sekundären Antikörper nach der Färbung, und in zukünftigen Experimenten bei 4 ° C zur Wiederverwendung speichern. Wenn der Antikörper zur Wiederverwendung gespeichert werden soll, fügen Sie 0,01% Natriumazid. </li><li> Immunostain die Embryonen etablierten Protokollen unter Verwendung von 18. </li></ol> 5. Visualisierung von Embryonen und Analyse von Zielgerichtete Pronephric Tissue <ol><li> Bildschirm, um die immunhistochemisch Embryonen zu überprüfen, ob die korrekte Blastomere durch Betrachten der Fluoreszenz des Tracers unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei 1X injiziert wurde (zu sehen ganze Embryo) und D5 (zu sehen Niere) Vergrößerung. Platz Embryonen in einer Multi-Well-Glasplatte mit dem wirlls gefüllt mit 1x PBT einer Transferpipette mit der Spitze mit abgeschnitten. Manipulieren die Embryonen mit einer Haarschleife. Nur Embryonen , die die co-injizierten Tracer , die in den pronephros auf der linken Seite des Embryos (3C, F und 4C, F) für die Gen - Überexpression oder Zuschlagsanalyse haben. </li><li> Alternativ deaktivieren Sie die Embryonen in Murrays Clear (2 Teile Benzylbenzoat: 1 Teil Benzylalkohol) durch die Embryonen in einem Glasfläschchen und das Fläschchen mit Murrays Klar füllen. Visualisieren Sie die Embryonen ein Glas-Well-Platte verwendet wird. Hinweis: Murray Clear ist ein organisches Lösungsmittel, und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Handschuhe tragen, und verwenden Sie nur Glasfläschchen und Pipetten mit Murrays Clear. </li><li> Store Embryonen bei 4 ° C in 1x PBT für 2 - 3 Wochen. Für die Langzeitlagerung von Embryonen, dehydratisieren die Embryonen durch zweimal in 100% Methanol bei Raumtemperatur für 10 min gewaschen. Speichern der Embryonen bei -20 ° C in 100% Methanol. </li></ol>

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D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting die pronephros der Entwicklung von Xenopus - Embryonen stützt sich auf die Identifizierung und die richtige Blastomere zu injizieren. Die Injektion des V2 Blastomere von 8-Zellen - Embryonen zielt auf die linke pronephros 18. Dies lässt die Gegenseite rechts pronephros als interne Kontrolle. Wenn Morpholino Knockdown oder RNA-Überexpression wird verwendet, Nierenentwicklung zu verändern, können die Gegenseite rechts pronephros verwendet werden, um die Auswirkungen von Knock-Down oder ?...

Die Xenopus embryonale Niere, die pronephros, ist ein gutes Modell der Nierenentwicklung und Krankheit zu studieren. Die Embryonen entwickeln extern, sind groß, in großen Stückzahlen hergestellt werden und werden durch Mikroinjektion oder chirurgische Eingriffe leicht manipulierbar. Darüber hinaus werden die Gene regeln Nierenentwicklung in Säugetieren und Amphibien konserviert. Mammalian Nieren Fortschritte durch drei Phasen: die pronephros, Mesonephros und metanephros 1, während der embryonalen Amphibien haben ein pronephros und erwachsene Amphibien haben ein metanephros. Die grundlegende Filtereinheit dieser Nierenformen ist das Nephron, und beide Säugetiere und Amphibien benötigen , um die gleiche Signalkaskaden und induktive Ereignisse 3 Nephrogenese 2, zu unterziehen. Die Xenopus pronephros einen einzigen nephron enthält proximaler zusammengesetzt, Zwischen-, distalen und Anschluss Tubuli, und eine Glomus (analog dem Säuger Glomerulus) 1, 4-6 (1 </strOng&gt;). Die einzelne, große Nephron in den Xenopus pronephros macht es geeignet als einfaches Modell für die Untersuchung von Genen in Nierenentwicklung und Krankheitsprozessen beteiligt. Zellschicksal Karten wurden für frühen Xenopus - Embryonen hergestellt und sind frei im Internet unter Xenbase 7-11 zur Verfügung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Mikroinjektion von Lineage Tracern , die Entwicklungs Xenopus pronephros zu zielen, wobei die gleiche Technik angepasst werden kann , andere Gewebe zu zielen, wie das Herz oder die Augen. Lineage Tracern sind Etiketten (einschließlich Vitalfarbstoffen, fluoreszierend markierte Dextrane, histochemisch nachweisbare Enzyme und mRNA kodiert, fluoreszierende Proteine), die in einem frühen Blastomere injiziert werden kann, so dass die Visualisierung der Nachkommen dieser Zelle während der Entwicklung. Dieses Protokoll nutzt MEM-RFP - mRNA, die Codierung Membran rot fluoreszierendes Protein 12 als Linie Tracer gezielt. Die gezielte Mikroinjektions techniken für einzelne Blastomeren in 4- und 8-Zellen-Embryonen hier beschriebene zur Injektion mit Morpholinos genutzt werden, um knock down Genexpression oder mit exogenen RNA ein Gen von Interesse überexprimiert. Durch die Injektion in die Bauch, pflanzliche Blastomere, in erster Linie die pronephros des Embryos wird gezielt werden, die kontralateralen pronephros als Entwicklungskontrolle verlassen. Co-Einspritzen eines Tracers verifiziert, dass der korrekte Blastomere injiziert wurde, und zeigt, welche in der Embryogeweben ergaben sich aus dem injizierten Blastomere, Verifizieren der pronephros Targeting. Immunostaining der pronephros ermöglicht die Visualisierung, wie gut die pronephric Tubuli gezielt wurden. Überexpression und Zuschlags Effekte können dann auf die Gegenseite des Embryos erzielt werden, die als Entwicklungskontrolle dient und verwendet werden kann , die pronephric Index 13 zu berechnen. Die Verfügbarkeit von Zellschicksal Karten ermöglicht diese gezielte Mikroinjektionstechnik verwendet werden, an Zielgewebe other als die pronephros und Co-Injektion eines fluoreszierenden Indikators erlaubt die gezielte Mikroinjektions zu jedem Gewebe vor der Analyse überprüft werden. Während der Embryomikroinjektions sollte Entwicklungstemperatur fest geregelt werden, da die Rate der Xenopus Entwicklung auf sie stark abhängig ist 14. (- 16 ° C 14) 4- und 8-Zellinjektionen, da die Entwicklungszeit verlangsamt Embryonen bei kühleren Temperaturen inkubiert werden. Bei 22 ° C, die Entwicklungszeit von Stufe 1 (1 Zelle) auf Stufe 3 (4 Zellen) beträgt etwa 2 Stunden, während bei 16 ° C Entwicklungszeit zu Stufe 3 ca. 4 Stunden. Es dauert etwa 15 Minuten von einem 4-Zellen-Embryo zu einem 8-Zellen (Stufe 4) Embryo bei 22 ° C zu gehen, aber dauert etwa 30 Minuten bei 16 ° C. In ähnlicher Weise bei 22 ° C, dauert es nur 30 Minuten für eine 8-Zell-Embryo zu einem 16-Zellen-Embryo (Stufe 5) fortzuschreiten. Diese Zeit wird bei 16 ° C auf 45 Minuten erhöht. Dasrefore, ist es nützlich, um die Entwicklungsrate der Embryonen zu verlangsamen, an der 8-Zellen-Stadium für Injektionszwecke ausreichend Zeit zu ermöglichen, bevor die Embryonen auf die Bühne 16-Zelle fortzuschreiten. Außerdem können Wachstumstemperaturen moduliert werden embryonale Entwicklung zu beschleunigen oder zu verlangsamen, bis die Niere vollständig entwickelt hat. Die Epidermis der Kaulquappe stufigen Xenopus - Embryonen ist relativ transparent, erlaubt eine einfache Abbildung der Entwicklung pronephros ohne Dissektion oder Lichtung des Gewebes 15. Aufgrund der relativen Transparenz von Xenopus - Embryonen ist die Abbildung lebender Zellen auch denkbar , 16,17. Whole-mount die pronephros zu visualisieren immunostaining ist möglich , mit etablierten Antikörper, die die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs ​​Tubuli der Stufe 38 beschriften - 40 Embryonen , die für die Beurteilung der pronephric Entwicklung ermöglichen nach Manipulation der Genexpression gezielt in Xenopus - Embryonen 18-20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

Die embryonale Niere von Xenopus laevis (Frosch), die pronephros, besteht aus einem einzigen Nephron, und kann als ein Modell für eine Nierenerkrankung verwendet werden. Xenopus - Embryonen sind groß, entwickeln außen und leicht durch Mikroinjektion oder chirurgische Verfahren manipuliert werden können. Darüber hinaus wurden für die frühen Xenopus - Embryonen Schicksal Karten hergestellt. Gezielte Mikroinjektion in den einzelnen Blastomeren, die Anlass schließlich zu einem Organ oder Gewebe von Interesse geben kann selektiv verwendet werden, um überexprimiert oder knock down Genexpression in diesem begrenzten Bereich, sinkende Nebenwirkungen in den Rest des sich entwickelnden Embryos. In diesem Protokoll beschreiben wir , wie etabliert Xenopus Schicksal Karten verwenden , um die Entwicklung von Xenopus Niere (die pronephros), durch Mikroinjektion in spezifischen Blastomere von 4- und 8-Zellembryos zu zielen. Die Injektion von Lineage Tracer ermöglicht die Verifizierung der spezifischen Ausrichtung der Injektion.Nach Embryonen entwickelt haben, 38 auf die Bühne - 40, ganz-mount Immunfärbung verwendet pronephric Entwicklung sichtbar zu machen, und der Beitrag von Zellen gezielt zu den pronephros beurteilt werden kann. Die gleiche Technik kann andere Gewebetypen angepasst werden, um den pronephros zusätzlich zu zielen.

Mikroinjektionen von 4- und 8-Zell Xenopus - Embryonen mit MEM-RFP mRNA zeigen verschiedene Ebenen zu den pronephros Targeting. 4 zeigt Stufe 40 Embryonen mit korrektem MEM-RFP mRNA Expressionsmuster. Embryos wurden in der linken ventral Blastomere (4A), und sortiert die richtige Expressionsmuster von MEM-RFP mRNA injiziert. Zusätzlich MEM-RFP im proximalen zum Ausdruck zu bringen, Zwischen- und distalen Tubuli der Niere, richtig injizierten Em...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K Aufrufe.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

Serie: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...