ここで報告された研究は、賞の下で国立衛生研究所の国立がん研究所によって部分的にサポートされました。R33 CA217702 と学生育成(IMSD)プログラムを最大化するためのイニシアチブ。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

ヒト血清検体は、IRBの承認の下で同意したボランティアから、そしてヘルシンキ宣言で述べられている原則に従って得られた。検体は、分析室に移る前にコード化され、同定を解除した。
1. サンプル準備
<ol><li>ヘプG2細胞ライセート
	<ol>
<li>16 T75フラスコに16個のT75フラスコに種子約10 x 106 HepG2細胞があり、10%のウシ胎児血清(FBS)を補充したEMEM培地14mLで、2日間細胞を増殖させる。</li>
		<li>RIPAバッファーを準備する:50 mLチューブに、5 M NaClの1.5 mL、1 MトリスHCl(pH = 7)の2.5 mL、NP-40試薬の500 μLを加え、DI水で50 mLに最終容積を持って来ます。</li>
		<li>溶解バッファーを準備する:50 mLチューブにRIPAバッファーのアリコート20 mLを追加し、タンパク質と脂質分解を阻害するために100xプロテアーゼ阻害剤溶液の200 μLを追加します。4 °Cで保管。 注意:リシスバッファーはTBARS試薬と互換性があり、532 nmでの吸光度を妨げません。別のリシスバッファーを使用するか、またはリシスバッファーに追加の成分を追加する場合は、リシスバッファーコンポーネントがTBARSアッセイと互換性があることを確認するために予備検証研究を行う必要があります。</li>
		<li>10%FBSを含む培地を取り出し、5 mLの冷たい滅菌1x PBSで細胞2倍を洗浄します。</li>
		<li>細胞を含むT75フラスコに1mLのリシスバッファーを加え、室温(RT)で10分間、一定の渦巻きでインキュベートし、バッファーが十分に分散されていることを確認します。</li>
		<li>適切にラベル付けされた2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブにライセートを収集し、氷の上で10分間インキュベートします。</li>
		<li>5,000 x g で 5,000 x g で細胞の破片を収集し、吸引上清上清を 15 mL チューブに入れ、RT で 10 分間回転させます。</li>
		<li>50°Cと3mbarでスピードVacを使用して上澄み液を4倍に濃縮し、それぞれ94 μLのアリコートを2mLのスナップキャップポリプロピレンチューブにします。サンプルは、インビトロ酸化やTBARSアッセイに使用されるまで、-80 °Cで保存します。 注:細胞の溶菌上清を集中させないように、細胞は、3 mLの1xトリプシンを使用して取り外し、6 mLの培地で中和し、5 mLの冷たいPBSで2倍洗浄することもできます。その後、細胞ペレットを250 μLのリシスバッファーで再構成し、ステップ1.1.6および1.1.7を実行することができます。</li>
		<li>酢酸(pH = 4)で35 mM CuCl2 ストック溶液を調製します。<ol>
<li>酢酸溶液を調製(pH = 4):100mLのDI水に1μLの氷酢酸を希釈します(pHは約4ですが、pHメーターでこれを確認してください)。さらに水または酢酸を加える 4 に pH を調整します。</li>
			<li>約0.1936 gの塩化銅を重量を量り、酢酸溶液(pH=4)の10mLに溶解し、144mM CuCl2 ストックを作ります。この溶液からアリコート490 μLを加え、1,510 μLの酢酸(pH = 4)を加え、35 mM CuCl2 溶液を作ります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>アリコート6 μLから35 mM CuCl2 ストック溶液を、94 μLの細胞溶解液を含む6個のサンプルに加え、最終的なCuCl2 濃度を約2 mMにします。コントロールとして使用する細胞溶解物の94 μLを含む6つのサンプルにCuCl2 を持たない酢酸溶液(pH = 4)の6 μLを加えます。細胞ライセートの最終容積は、TBARSアッセイに使用される100 μLである必要があります。 注:35 mM CuCl2 を酢酸(pH = 4)でストック溶液にすることは、水酸化銅の沈殿を防ぐために必要です。</li>
		<li>37 °Cのオーブンでサンプルを24時間インキュベートし、最終容積100 μLを含む各サンプルに対してTBARSアッセイを行います。</li>
		<li>ステップ 1.1.9 および 1.1.11 2x を別々の日に繰り返して、HepG2細胞溶解物の TBARS アッセイの再現性を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>低密度リポタンパク質 注:典型的には、予精製された低密度リポタンパク質(LDL)は、EDTAのいくつかの量を含む。ここで使用するLDLサンプルは0.01%EDTAを含んでいます。EDTAは、インビトロCu(II)媒介酸化LDLを阻害することができます。したがって、実験または分析の前に、LDLサンプルからEDTAを除去する必要があるかもしれません。ステップ 1.2.1 – 1.2.5 では、このプロセスについて説明します。 注意:水酸化ナトリウムは腐食性であり、皮膚や目に刺激を与えます。適切な個人用保護具を使用してください。<ol>
<li>アリコート24 μLは、5.51 mg/mL LDLストック(BSAを標準として使用した改変ローリー法により求められるタンパク質濃度)から、適切に標識された1 mLスナップキャップポリプロピレンチューブに。必要に応じてアリコートを作り、酸化やTBARSアッセイに使用するまで4°Cで保存してください。</li>
		<li>NaOHビーズでpH = 7に調整された0.15 MのHePESバッファを10 mM HEPESバッファーに調製する:水の0.49 LにNaClの4.39 gを溶解し、HEPESの1.19 gを加えます。かき混ぜる棒でよく溶かす。pHが7になるまで水酸化ナトリウムビーズを加えます。水で0.5Lに希釈します。バッファーを4 °Cで保存し、3ヶ月以内に使用してください。</li>
		<li>0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファの476 μLをアリクォートLDLサンプルに加えて、最終体積を500 μLにします。希釈LDLサンプルを、分子量カットオフ100Kの0.5 mL遠心スピンフィルター装置に加えます。</li>
		<li>RTで10分間14,000 x gでサンプルを回し、最終的なリテンテート体積は約30μLです。0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファの480 μLのサンプルを再構成し、RTで10分間14,000 x gで再びスピンします。</li>
		<li>フィルターデバイスを逆さまにして新しい2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブに、遠心分離機を1000 x gで2分間置き、LDLサンプルを収集します(最終容積= 約30 μL)。</li>
		<li>アリコートサンプルを適切にラベル付けした1 mLチューブにし、各サンプルに20 μLの水を加え、最終的な体積50 μLを達成します。</li>
		<li>酢酸中200 μM CuCl2 ストック溶液の調製 (pH = 4)<ol>
<li>酢酸溶液を調製(pH=4):ステップ1.1.9.1を参照してください。</li>
			<li>144 mM CuCl2 ストック溶液(ステップ1.1.9.2を参照)を準備し、144 mM CuCl2 ストックからアリコート5.5 μLを調製し、最終体積4 mLの酢酸(pH = 4)に溶解して200 μM溶液を作ります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>200 μM CuCl2 ストック溶液のアリコート 2.7 μL を、50 μL の LDL を含む 6 つのサンプルに加え、CuCl2 濃度を約 10 μM にします。コントロールに使用する50 μLのLDLを含む6サンプルにCuCl2 を含まない酢酸溶液(pH = 4)から2.7 μLを加えます。</li>
		<li>37 °Cのオーブンで2時間のLDLサンプルをインキュベートする。 2時間後、0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファを持つ各サンプルの最終体積を100 μLにします。直ちにTBARSアッセイを実行します。</li>
		<li>ステップ 1.2.3 ~ 1.2.9 2x を 2 つの異なる日に繰り返して、TBARS アッセイの再生産をテストします。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒト血清
	<ol>
<li>ヒト血清サンプルから、それぞれ94 μLのアリコートを2mLのスナップキャップポリプロピレンチューブに作り、サンプルを-80 °Cで保存します。</li>
		<li>酢酸(pH = 4)で35 mM CuCl2 ストック溶液を調製する:ステップ1.1.9を参照してください。</li>
		<li>CuCl2ストック溶液からアリコート6 μLを、94 μLのヒト血清を含む6個のサンプルに加え、最終的なCuCl2濃度を約2mMにします。コントロールとして使用するヒト血清94μLを含む6つのサンプルにCuCl2を持たない酢酸溶液(pH = 4)の6 μLを加えます。</li>
		<li>37 °Cのオーブンで24時間のヒト血清サンプルをインキュベートし、TBARSアッセイ(セクション4)で酸化のレベルを決定します。</li>
		<li>ステップ 1.3.2 ~ 1.3.4 2x を 2 つの別々の日に繰り返して、TBARS アッセイの再現性を判断します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 試薬の準備
注意:チオバルビツール酸は皮膚や眼の刺激を引き起こし、吸入や皮膚吸収によって有害である可能性があります。酢酸は、吸入すると内臓に損傷を与える可能性があります。ヒュームフードですべての酸溶液を準備します。
<ol><li>8.1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液の調製<ol>
<li>32.4 gのSDSを重み出し、350 mLのDI水にビーカーで溶解します。SDSを静かに溶解し、気泡を作らないように磁気攪拌バーを使用してください。DI水で最終容積を400mLに持ち込み、RTでSDSソリューションを保存します。 注:ここでは、余分な8.1%のSDSソリューションが用意されています。しかし、96個のサンプルでは、8.1%のSDS溶液のうち約20mLしか必要ありません。分析するサンプルの数に応じて、このソリューションを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.5 M酢酸ナトリウム緩衝液の調製(pH=4)<ol>
<li>氷酢酸を100mLのDI水350mLでビーカーに希釈します。磁気攪拌棒を使用して、軽く溶解します。</li>
		<li>水に水酸化ナトリウムビーズを使用して6.5 M NaOH溶液を調製します。NAOHビーズ13gを40mLのDI水に溶かし、DI水で50mLの最終体積に持ち込みます。</li>
		<li>6.5 M NaOH溶液の約46mLを酢酸溶液にゆっくりと加えながら、攪拌棒と混合します(pHを4に上げるはずですが、pHメーターを使用して測定しながらNaOH溶液をゆっくりと添加して確認してください)。</li>
		<li>DI水で500mLに最終容積をもたらし、RTで酢酸ナトリウムバッファーを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チオバルビツール酸の0.8%水溶液の調製(pH= 4に調整) 注:このステップでは、チオバルビツール酸の調製は、大量のサンプルが分析される予定であるため、最適化されています(108サンプル、標準を含まない)。分析のために計画されたサンプルの数に応じて、このソリューションを準備します。<ol>
<li>水酸化ナトリウムビーズと水を使用して5 M水酸化ナトリウム溶液を調製する:水酸化ナトリウムビーズの4 gを水の最終容積に溶解します。プラスチック容器に保管してください。このソリューションは、バッチごとに新たに準備する必要があります。</li>
		<li>チオバルビツール酸の重量4gとDI水の450 mLを加えます。磁気攪拌棒を使用して、軽く溶解します。 注:このソリューションは最終的に500 mLの総容量に持ち込まれます。</li>
		<li>チオバルビツール酸を攪拌棒で溶解しながら、5 M NaOH溶液の約3 mLを100 μL単位で(ゆっくりと、滴下して)加えます。NaOH溶液を添加した後、チオバルビツール酸粒子が溶解し始める。</li>
		<li>チオバルビツール酸粒子がまだ完全に溶解していない場合は、チオバルビツール酸粒子がすべて完全に溶解するまで、5 M NaOH溶液を100 μL単位で追加します。この特定の溶液量については、5 M NaOH溶液の合計4 mLを添加し、チオバルビツール酸粒子を完全に溶解する。 注:この濃度では、チオバルビツール酸はpHが4近くでない限り完全に溶解しません。</li>
		<li>チオバルビツール酸が完全に溶解した後、NaOHを添加し停止します。4のpHを超えないようにしてください。最終的なpHは、チオバルビツール酸溶液を混合してpH紙に入れて1μLを取り出すことで検証できます。</li>
		<li>DI水で500mLに最終容積をもたらし、水性0.8%チオバルビツール酸溶液をRTに保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)標準サンプル製剤
注意:マロンジアルデヒド(MDA)は不安定で、市販されていません。しかし、MDAテトラブチランモニウム塩、MDAビス(ジメチルアセタール)、MDAビス(ジエチルアセタール)など、市販されているMDAにはさまざまな化学的形態があります。これらの3つの化学形態のうち、MDAビス(ジメチルアセタール)は、研究の大半がこの同じ標準21,22を使用するため、ここで使用されています。MDAの他の2つの化学形態を使用することを選択した場合、その適合性の事前検証を行う必要があります。
<ol><li>純MDAビス(ジメチルアセタール)92 μLを1LのDI水に希釈して、550 μM MDAビス(ジメチルアセタール)ストック液を調製します。磁気攪拌棒を使用して溶液を10分間完全に混合します。4 °Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。</li>
	<li>200 μM MDA ビス(ジメチルアセタール)を、1274 μLのDI水の550 μM MDAビス(ジメチルアセタール)ストックから726 μL希釈して準備します。この200 μM MDAビス(ジメチルアセタール)溶液は、TBARSアッセイが実行されるたびに新鮮に調製する必要があります。</li>
	<li>標準曲線の準備:8つの2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブを取り、200 μMストックからMDAビス(ジメチルアセタール)を追加し、 表1に記載されているように水で希釈するAからHまで文字でラベル付けします。</li>
	<li>8本のガラス管(13mm x 100 mm)を取り、A-Hにラベルを付け、対応するチューブに100 μLの標準を追加します。ブランク規格(サンプルA)に対して6回の複製を行い、TBARSアッセイの検出限界を計算します。 注: プロトコルは、1 時間以下でここで一時停止できます。</li>
</ol>4. TBARSアッセイ
メモ:TBARSアッセイが開始されると、停止せずに終了する必要があります。
<ol><li>分析するサンプルの数に必要な数のガラス管を取り、サンプルの名前をラベル付けします。次に、各ガラス管に(上記の通り)各サンプルを100μL加えます。</li>
	<li>各サンプルと標準に8.1%SDSの200 μLを加え、ガラスチューブを円運動でそっと旋回してサンプルを混合します。</li>
	<li>3.5 M酢酸ナトリウムバッファー (pH = 4) の 1.5 mL を各サンプルと標準に加えます。</li>
	<li>水性0.8%チオバルビツール酸溶液(pH = 4)を各サンプルと標準に1.5mL添加します。</li>
	<li>700 μLのDI水を加えることで、各サンプルと標準の最終体積を4 mLにします。</li>
	<li>各ガラス管をしっかりとキャップし、1時間95°Cに設定した加熱ブロックでインキュベートします。ガラス管をアルミホイルで覆い、チューブの上部で結露を防ぎます。</li>
	<li>加熱ブロックからガラス管を取り出し、氷の上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機サンプルと標準は1500 x gで、4°Cで10分間です。 遠心分離後、サンプルと規格を含むガラス管をRTに保管してください。 注:サンプルを氷の上または4°Cに保つと、サンプル全体または標準物が沈殿します。</li>
	<li>遠心分離の直後に、各チューブから150μLの上清をアリコートし、96ウェルプレートの別のウェルに入れます。</li>
	<li>ピペットチップを使用して、各ウェルから気泡を取り除きます。 注:気泡の存在は、高いアッセイの不正確さにつながる、不一致の吸光度の読み取りをもたらす。</li>
	<li>532 nmで吸光度を読み取る。他のすべての吸光度測定値からブランクサンプルの平均吸光度測定値を引きます。</li>
	<li>空白差の吸光度測定値を532 nmでプロットし、各標準の既知の濃度をプロットして、標準曲線を作成します。線形回帰を使用してデータポイントを適合します。標準曲線から得られた線形回帰線の式を使用して、未知のサンプル濃度を計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+(MDA)+and+relatives+in+biological+samples:+Analytical+and+biological+challenges.">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li><li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid.">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress.">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li><li>Morales, M., Munn&#233;-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde:+Facts+and+artifacts.">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li><li>Devasagayam, T. 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M., Guill&#233;n-Sans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-thiobarbituric+acid+test+for+lipid+oxidation+in+food:+Synthesis+and+spectroscopic+study+of+2-thiobarbituric+acid-malonaldehyde+adduct.">2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).</li><li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+lipid+peroxidation+product+as+a+potential+trigger+of+the+p53+pathway.">Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).</li><li>Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. 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Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).</li><li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides.">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li><li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents.">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li><li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry.">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li><li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal,+malonaldehyde+and+related+aldehydes.">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey.">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS/MS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+(MDA)+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization:+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15(S)-8-iso-prostaglandin+F2&#945;+and+nitric+oxide+(NO).">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2&#945; and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin:+A+role+for+autoxidative+glycation.">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li><li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反を開示する必要はありません。

その限界にもかかわらず1、3、4、7、8、10、12、13、14、15、19および実験室間の比較のた?...

脂質過酸化は、活性酸素種や反応性窒素種などのフリーラジカルが、脂質中の炭素炭素二重結合を攻撃するプロセスであり、炭素からの水素の抽象化と酸素分子の挿入を伴うプロセスである。このプロセスは、主要な製品として、脂質ペルオキシルラジカル、およびヒドロペルオキシドを含む複雑な製品の混合物、ならびに主要な二次製品としてマロンジアルデヒド(MDA)および4-ヒドロキシノンを含む。
MDAはチオバルビツール酸(TBA)との容易な反応による脂質過酸化のマーカーとして、生物医学研究で広く使用されています。この反応は、532 nmの可視スペクトルで吸収し、赤-ピンク色2を生成するコンジュゲートであるMDA-TBA2の形成につながります。MDA以外の脂質過酸化に由来する他の分子も、TBAと反応して532nmで光を吸収し、測定される全体的な吸収シグナルに寄与する。同様に、MDAは生体分子の他のほとんどの主要クラスと反応することができ、TBA3,4との反応に対するアクセシビリティを制限する可能性があります。したがって、この伝統的なアッセイは、単に「チオバルビツール酸反応性物質」またはTBARS5を測定すると考えられています。
TBARSアッセイは、正しく適用され、解釈されると、一般的に生物学的サンプル6における酸化ストレスの全体的なレベルの良好な指標と考えられます。残念ながら、Khoubnasabjafariと他の人によって文書化されているように、TBARSアッセイはしばしば疑わしい結論3、4、7、8、9、10、11を容易にする方法で行われ、解釈されます。この原因は、主にサンプル関連の前分析変数と、アッセイ結果の大幅な変更なしにアッセイプロトコルの一見軽微な変動を禁止するアッセイ堅牢性の欠如に根ざしています1,7,12,13。
生体試料の取り扱いと保存に関連する前分析変数(例えば、血漿を-20°Cに一時的に保つ)14,15は、TBARSアッセイ結果に大きな影響を与える可能性があります16,17;TBARSアッセイの結果は、明示的なラボ間分析検証データによって保証されない限り、異なる実験室間で比較されるべきではありません。この推奨事項は、ウエスタン ブロットの一般的な使用方法と解釈方法に似た方法です。バンド密度の比較は、ブロット内およびおそらく実験室内の研究に有効であるが、実験室間のバンド密度を比較することは一般的に無効な慣行と考えられる。
一部の研究者は、TBARSアッセイによって測定されたMDAが、許容可能なバイオマーカー3、9,10、18,19に必要な分析基準または臨床基準を単に満たしていないことを示唆している。確かに、50年以上前にアッセイが開発されていなかったら、今日の広範な使用と暗黙の受け入れ能力を得ることはなかったでしょう。酸化ストレスの決定に使用される分析感度、特異性、および堅牢性を有するアッセイは他にもありますが、532nmでの吸光度に基づくTBARSアッセイは、脂質過酸化20の決定に最も一般的に使用されるアッセイの1つであり、それによって酸化ストレスの評価を行います。
TBARSアッセイは、使用される試薬のほとんどの濃度に関する詳細な情報を提供しない高価なキット(400米ドル以上)としてのみ見つけることができます。また、提供される試薬は、1キットにつき1つの色分け標準曲線しか作ることができないため、1つの実験にのみ使用できます。これは、同じ標準曲線を複数回使用できないため、異なるタイムポイントで数サンプル内の酸化レベルを決定しようとする研究者にとって問題になる可能性があります。したがって、複数の実験のために複数のキットを購入する必要があります。現在、高価なキットを購入しない限り、TBARSアッセイの実行方法に関する詳細なプロトコルはありません。過去に一部の研究者は、TBARS assay21,22を実行する方法を漠然と説明してきましたが、高価なキットなしでTBARSアッセイを行う方法に関する完全に詳細なプロトコルや包括的なビデオは文献で入手できません。
ここでは、簡単で再現性の低い方法でTBARSアッセイを実行する方法に関する詳細で分析的に検証された目的別方法論を報告します。ヒト血清の脂質過酸化、HepG2溶糖、およびCu(II)イオンによる処理時の低密度リポタンパク質の変化が、TBARSアッセイの例示的な用途として実証されています。結果は、このTBARSアッセイが日常的に一貫して再現可能であることを示しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>101642--262</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL self-standing centrifuge tube</td>
			<td>Corning, NY</td>
			<td>CLS430897</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>280895</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>LDL purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for glass tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>14-930-15D</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper II Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>222011-250G</td>
			<td>to induce oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>HepG2 cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf, NY</td>
			<td>22363204</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Genesee Sceitific, CA</td>
			<td>22363352</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum US Source</td>
			<td>Omega Scientific, CA</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>27225-1L-R</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>87786</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td>LDL solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 Cells</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>75002431</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology, GA</td>
			<td>12-16-120412</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>58948-025</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>8207560250</td>
			<td>TBARS Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>51119200</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>EMD Millipore Corp, MA</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td>For concentrating cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td>
			<td>USA Scientific, FL</td>
			<td>658175</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiobarbituric Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>T5500-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Fluka, GA</td>
			<td>93362</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1x)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>16777-166</td>
			<td>To detach HepG2 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

分析上の特異性と堅牢性は限られているにもかかわらず、チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)アッセイは、生体液中の脂質過酸化の一般的な指標として広く使用されています。生体試料内の酸化ストレスのレベルを示す良い指標と考えられることが多く、サンプルが適切に処理され保存されていることが考えられます。このアッセイは、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒド(MDA)、チオバルビツール酸(TBA)との反応を伴い、TBARSと呼ばれるMDA-TBA2付加物の形成につながります。TBARS は 532 nm で分光光度を測定できる赤ピンク色を生成します。TBARSアッセイは、酸性条件下(pH = 4)で、95°Cで行います。 純粋なMDAは不安定ですが、これらの条件はMDAビス(ジメチルアセタール)からMDAを放出することを可能にし、この方法で分析標準として使用されます。TBARSアッセイは、約2時間で完了できる簡単な方法です。アッセイ試薬の調製について、詳細を説明します。予算重視の研究者は、単一の標準曲線の構築のみを可能にする高価なTBARSアッセイキットを購入するのではなく、これらの試薬を低コストで複数の実験に使用することができます(したがって、1つの実験にのみ使用できます)。このTBARSアッセイの適用可能性は、ヒト血清、低密度リポタンパク質、および細胞ライセートで示されている。アッセイは一貫して再現可能であり、1.1 μMの検出限界に達することができる。分光光度TBARSアッセイの使用および解釈に関する推奨事項が提供される。

酸性条件下(pH = 4)および95°Cでは、マロンジアルデヒド(MDA)ビス(ジメチルアセタール)はMDA23を生成します。MDAと密接に関連する化学共因は、チオバルビツール酸(TBA)の2分子と反応してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)と呼ばれる化合物を生成し、赤色ピンク色を与え、532nmで吸光度λmax を有する(図1、 図2)。標準としてMD...

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Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

チオバルビト尿酸反応性物質アッセイの目的は、532nmの可視波長分光光度測定を用いて、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒドの生産を測定することによって生体試料中の酸化ストレスを評価することです。ここで説明する方法は、ヒト血清、細胞ライセート、および低密度リポタンパク質に適用することができる。

チオバルビツール酸反応性物質アッセイを用いた生体試料における酸化ストレスの評価

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Research

JoVE Journal

Chemistry

27.3K ビュー.  Arizona State University. チオバルビト尿酸反応性物質アッセイの目的は、532nmの可視波長分光光度測定を用いて、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒドの生産を測定することによって生体試料中の酸化ストレスを評価することです。ここで説明する方法は、ヒト血清、細胞ライセート、および低密度リポタンパク質に適用することができる。

ビデオ: Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

化学

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

MTTアッセイにより合成と細胞毒性の評価：抗がん金属錯体

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. Herein, nitrogen is presented as a novel supercritical drying fluid for specialized applications such as in the processing of reactive porous materials, where carbon dioxide and other fluids are not appropriate due to their higher chemical reactivity. Nitrogen exhibits similar physical properties in the near-critical region of its phase diagram as compared to carbon dioxide: a widely tunable density up to ~1 g ml-1, modest critical pressure (3.4 MPa), and small molecular diameter of ~3.6 &#197;. The key to achieving a high solvation power of nitrogen is to apply a processing temperature in the range of 80-150 K, where the density of nitrogen is an order of magnitude higher than at similar pressures near ambient temperature. The detailed solvation properties of nitrogen, and especially its selectivity, across a wide range of common target species of extraction still require further investigation. Herein we describe a protocol for the supercritical nitrogen processing of porous magnesium borohydride.

Nitrogen is an effective supercritical fluid for extraction or drying processes due to its small molecular size, high density in the near-liquid supercritical regime, and chemical inertness. We present a supercritical nitrogen drying protocol for the purification treatment of reactive, porous materials.

反応性多孔質材料を精製するための超臨界窒素処理

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Using Polystyrene-block-poly(acrylic acid)-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are encapsulated in polystyrene-block-poly(acrylic acid) (PSPAA) shells and then used as monomers for their self-assembly. Spherical PSPAA micelles upon acid treatment are known to assemble into cylindrical micelles. Exploiting this tendency, the core-shell nanoparticles are induced to aggregate, coalesce, and then transform into long chains. When more than one type of nanoparticles are used, random and block &#8220;copolymers&#8221; of nanoparticles can be obtained. Detailed procedures are reported for the PSPAA encapsulation of nanoparticles, homo- and co-polymerization of the core-shell nanoparticles, separation and purification of the resulting nanoparticle chains. Transformations of single-line chains into double- and triple-line chains are also presented. The synergy between the polymer shell and the embedded nanoparticles leads to an unusual chain-growth polymerization mode, giving long nanoparticle chains that are distinct from the products of the traditional step-growth aggregation process.

Using Polystyrene-block-polyacrylic acid-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We report protocols for &#8220;polymerizing&#8221; various types of polymer-encapsulated metal nanoparticles into long chains of &#8220;homo-&#8220; and &#8220;co-polymers&#8221;.

ポリスチレンを使用しました<em&gt;ブロック</em&gt; - ポリ（アクリル酸）は、それらのホモポリマーおよび共重合用単量体として金属ナノ粒子をコーティングを採用

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide (CdSe@CdS) nanorod photocatalysts. Seeded rods are grown using a colloidal hot-injection method and then moved to an aqueous medium by ligand exchange. CdSe@CdS nanorods, an iridium precursor and other salts are mixed and illuminated. The deposition process is initiated by absorption of photons by the semiconductor particle, which results with formation of charge carriers that are used to promote redox reactions. To insure photochemical oxidative growth we used an electron scavenger. The photogenerated holes oxidize the iridium precursor, apparently in a mediated oxidative pathway. This results in the growth of high quality crystalline iridium oxide particles, ranging from 0.5 nm to about 3 nm, along the surface of the rod. Iridium oxide grown on CdSe@CdS heterostructures was studied by a variety of characterization methods, in order to evaluate its characteristics and quality. We explored means for control over particle size, crystallinity, deposition location on the CdS rod, and composition. Illumination time and excitation wavelength were found to be key parameters for such control. The influence of different growth conditions and the characterization of these heterostructures are described alongside a detailed description of their synthesis. Of significance is the fact that the addition of iridium oxide afforded the rods astounding photochemical stability under prolonged illumination in pure water (alleviating the requirement for hole scavengers).

A protocol for the photochemical oxidative growth of small crystalline iridium oxide nanoparticles on the surface of CdSe@CdS seeded rod nanoparticles is presented.

CdSeの@のCdSナノロッド上にイリジウム酸化物ナノ粒子の光化学酸化成長

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

アルデヒドおよびケトン類の反応性の重亜硫酸塩の抽出のプロトコルを使用して混合物からの分離

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

シルクベース自走式マイクロスターラーの反応性インクジェット印刷と推進力解析

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...