Die Autoren möchten anerkennen, dass diese Forschung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union für das PATROLS-Projekt im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 760813 gefördert wurde.

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Anwendungen für 3D-Lebermodelle variieren erheblich, je nachdem, auf den jeweiligen biochemischen Endpunkt oder den unerwünschten Ergebnisweg gezielt. Jedes Modell hat seine Vorteile und Einschränkungen, von Interdonor Variation in primären menschlichen Hepatozyten (PHH) Modelle zu reduzierten Cytochrom p450 Aktivität in Zelllinien-basierten Modellen, aber alle sind wertvoll in ihrem eigenen Recht6,12,18,19. Bei der Bewertung der Genotoxizität gibt es Einschränkungen in den Modellen Kompatibilität mit gesetzlich zugelassenen Endpunkten wie der In-vitro-Mikrokern-Assay, da aktive Proliferation erforderlich ist. Dies ist notwendig, da die Genotoxizitätsbewertung erfordert, dass die Quantifizierung von festen DNA-Schäden nach der Zellteilung bewertet wird, wenn die Möglichkeit besteht, dass die DNA-Reparatur vorübergehende Läsionen korrigiert. Leider bilden hochdifferenzierte Hepatozyten (d.h. HepaRG) sphäroide oder PHH-Mikrotissues, die als die physiologisch relevantesten leberähnlichen Eigenschaften gelten, statische (nicht-proliferative) Modelle12,19,20. Daher bietet das hier vorgestellte 3D HepG2 Sphäroid-Modell ein geeignetes, alternatives Modell, das Genotoxizitätstests unterstützen kann. HepG2-Zelllinien-basierte Sphäroide haben genügend aktiv teilende Zellen auf der außenoberfläche der Sphäroide unter Beibehaltung grundlegender leberähnlicher Eigenschaften, wie Albumin- und Harnstoffproduktion und einige CYP450-Aktivität5,12,19. Hauptsächlich wurde dieses In-vitro-Lebermodell entwickelt, um den Mikrokern-Assay zu ergänzen, da dies einer der beiden In-vitro-Assays ist, die in der Batterie für Genotoxizitätstests8,10,11,21empfohlen werden. Das Modell kann jedoch problemlos auf DNA-Sequenzierungsanalysen und Genexpressionstechnologien (RNA) angewendet werden, während es das Potenzial hat, weiter angepasst und für andere DNA-Schadensendpunkte wie den Kometentest genutzt zu werden. Nichtsdestotrotz ist es wichtig, die Rolle zu berücksichtigen, die ENM-Interferenzen bei einigen Endpunktanalysen spielen. Beispielsweise sind Strömungszytometrie-basierte Analysen möglicherweise nicht für die ENM-Genotoxizitätsbewertung geeignet, insbesondere aufgrund von Partikelstörungen22.
Ein begrenzender Faktor von Sphäroidmodellen, die sich aktiv einer Zellteilung unterziehen, ist ihre Größe. Die Optimierung der Saatdichte ist von entscheidender Bedeutung, da genügend Zellen vorhanden sein müssen, die es dem Modell ermöglichen, sich weiter auszumehren. aber nicht zu hoch eine Zellzahl, was dazu führt, dass das Sphäroid übermäßig kompakt wird, was zu einem erhöhten nekrotischen Kern führt. Die Ursache dieser Nekrose wird geglaubt, um eingeschränktsauerstoff- und Nährstoffdiffusion sein, da die Grenze dieser Diffusion wird angenommen, dass etwa 100 – 150 m Gewebe23,24. Dies hängt jedoch vom Zelltyp, der Zellnummer, den Gerüstinteraktionen und den Kulturbedingungen25ab. Seitdem hat sich gezeigt, dass etwa 700 m Durchmesser die Grenze zur Vermeidung eines vorzeitigen Beginns der Nekrose in der Mitte von C3A-Sphäroiden ist, die Aussaat von 4000 HepG2-Zellen pro Sphäroid stellt sicher, dass der Durchmesser des Modells zum Zeitpunkt der Exposition ≤500 m26beträgt. Darüber hinaus stellten Shah et al. fest, dass HepG2-Zellen mit einem Samen von mehr als 5000 Zellen pro Sphäroid nach 7 Tagen in der Kultur eine 25%ige Verringerung der Lebensfähigkeit aufwiesen, was sich auf den durchschnittlichen Durchmesser von 680 m und die begrenzte Verfügbarkeit von Nährstoffen in einem 20-L-Hängetropfen5beziehen konnte. Um dies zu überwinden, durchläuft das im vorliegenden Protokoll entwickelte Modell einen kritischen Schritt, bei dem der hängende Tropfen nach der Erstbildung des Sphäroids in Agarose-beschichtete Brunnen übertragen wird. Dies stellt sicher, dass ein größeres Volumen an Kulturmedium vorhanden ist, um die ständig wachsende Anzahl von Zellen innerhalb der Sphäroide zu erhalten. Infolgedessen bleibt das HepG2 Sphäroid-Modell nach 10 Tagen in der Kultur über 70% lebensfähig und kann für die langfristige Gefährdungsbeurteilung in vitro genutztwerden. 
Während das HepG2 Sphäroid-Modell sowohl akute als auch langfristige Expositionsregime unterstützen kann, ist die Erfrischung des Zellkulturmediums während längerer Kulturperioden für dieses Modell eingeschränkt, da ein vollständiger Ersatz des Mediums aufgrund des potenziellen Verlusts der Sphäroide nicht empfohlen wird. Es wird vermutet, dass bei ENM-Expositionen die Tendenz zu homogenen ENM-Dispersionen zu Agglomerat und Sediment hoch ist. Es ist jedoch bemerkenswert, dass die Rate, mit der ein ENM-Sediment je nach Denplyse parametern (z. B. Größe, Form und Dichte) variieren kann und theoretisch anhand des In-vitro-Sedimentations-, Diffusions- und Dosimetriemodells (ISDD) oder seiner jüngsten Derivate bestimmt werden kann, auf die bei ENM-Expositionsansätzen oft Bezug genommen wird27,28. Dabei wird angenommen, dass, wenn nur 50% des Zellkulturmediums vorsichtig von der Oberfläche der Zellkultur entfernt werden, die Störung und anschließende Entfernung der ENM-Dosis theoretisch minimal sein sollte. Mit Brownian Bewegung im Spiel, kann dies jedoch nicht unbedingt der Fall sein und weitere Arbeiten in der Ablagerung und Sedimentation jedes einzelnen ENM getestet werden sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die richtige Dosimetrie während der langfristigen Expositionsregime beibehalten wird27. Grundsätzlich ist dies eine potenzielle Einschränkung, die bei der Durchführung wiederholter Dosiersysteme zu berücksichtigen ist, da dies für die endgültige, akkumulierte Konzentration von entscheidender Bedeutung sein könnte. Chemische Expositionen hingegen bieten, auch wenn sie nicht ohne ihre eigenen Einschränkungen zu berücksichtigen sind, einen vereinfachteren Ansatz, da chemische Stoffe tendenziell in Lösung bleiben und somit ein direkter Ersatz der ursprünglichen chemischen Konzentration zusätzlich zur neu zugesetzten Konzentration dafür sorgt, dass alle Chemikalien, die während der Medienerfrischung verloren gehen, entsprechend ersetzt werden29. Zukünftige Anwendungen würden die Bewertung der Eignung des Modells für wiederholte Expositionsregime über langfristige Kulturperioden umfassen, da wiederholte Dosierstrategien von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung der Fähigkeit eines bestimmten Organsystems sind, die durch die Bioakkumulation einer xenobiotischen Substanz verursachten nachteiligen Auswirkungen zu mildern oder zu überwinden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses 3D-In-vitro-Hepatikmodell in der Lage ist, eine Reihe realistischer Expositionsszenarien zu bewerten und damit einen zukünftigen In-vitro-Ansatz bereitzustellen, um sowohl enM als auch die Bewertung chemischer Gefahren routinemäßig und leicht zugänglich zu unterstützen.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Aufgrund der raschen Entwicklung und Umsetzung einer Vielzahl von technischen Nanomaterialien (ENM) in einer Vielzahl von anwendungen auf menschlicher Basis (z. B. Lebensmittel, Kosmetik, Bekleidung, Sportausrüstung, Elektronik, Transport und Medizin) ist es unvermeidlich, dass der Mensch regelmäßig ENM ausgesetzt wird. Damit wächst die Sorge, dass die neuartigen, größenspezifischen physiochemischen Eigenschaften, die diese Materialien in zahlreichen Anwendungen für vorteilhaft erachten, gleichzeitig negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die Umwelt haben könnten. Derzeit gibt es viele internationale Aktivitäten, um physiologisch relevantere Expositionen gegenüber diesen ENM aktiv widerzuspiegeln und die potenzielle Toxizität dieser Materialien über akute, langfristige und wiederholte Szenarien mit niedriger Dosis exposition zu bewerten.
Hepatische Toxikologie ist der Schlüssel bei der Betrachtung der ENM-Exposition, da allgemein bekannt ist, dass die Leber ein wichtiger Ort der ENM-Akkumulation nach der Exposition1,2ist. Darüber hinaus ist die Leber das primäre Organsystem für den Stoffwechsel und die Entgiftung von Substanzen, die in den systemischen Kreislauf gelangen3. Basierend auf dem akzeptierten Verständnis, dass 2D-Hepatozytenmodelle die Komplexität komplizierter multizellulärer Wechselwirkungen nicht genau imitieren oder die in vivo beobachtete metabolische Aktivität angemessen darstellen, wurde ein größerer Fokus auf die Entwicklung robuster und physiologisch relevanter In-vitro-3D-Lebermodelle für In-vivo-Ersatztechnologien festgelegt4,5. Der Einsatz fortschrittlicher 3D-Kulturtechnologien verbessert die Langlebigkeit von In-vitro-Lebermodellen, so dass langfristige, wiederholte Expositionsregime untersucht werden können. Darüber hinaus fördert dieses fortschrittliche Kulturformat die Bildung verbesserter physiologischer, organotypischer Merkmale wie Gallenkanaliculi, aktive Transporterprozesse und verbesserte CYP450-Wirkstoffmetabolisierungsfähigkeiten, wodurch die Prädiktodibilität der Modelle6verbessert wird. Aktuelle 3D-In-vitro-Hepatikmodelle, die aus Monokulturen (nur Hepatozyten) oder Kokulturen (Hepatozyten mit nichtparenchymalen Zellen) bestehen, existieren in mehreren Formaten, von Mikrotissues oder Sphäroiden in ultraniedrigen Haftplatten, hängenden Tropfensphäroiden, In Matrizen und/oder Gerüsten eingebetteten Zellen und mikrofluidischen Zellkulturplattformen, die alle als effektive fortgeschrittene In-vitro-Modelle für die Beurteilung der Lebertoxizität6,7gelten. Die meisten dieser Modellsysteme sind jedoch wartungsarm, erfordern spezielle Ausrüstung und sind teuer. Darüber hinaus sind diese Modelle häufig statisch (d. h. nicht dividierende Zellmodelle), die ihre Verwendung bei der Bewertung von Gefahrenendpunkten verhindern, wie z. B. Genotoxizitätstests mit Methoden, die feste DNA-Schäden quantifizieren. Genotoxizität ist eine wesentliche Voraussetzung in der regulatorischen Toxikologie, und es ist ein wichtiger Bestandteil der Risikobewertung von giftem Mittel8. Es gibt keinen einzigen Test, der angewendet werden kann, um alle Formen von DNA-Schäden zu quantifizieren, die nach der Exposition gegenüber einem exogenen Mittel auftreten können. Ein Kernbestandteil der In-vitro-Genotoxizitätstestbatterie ist jedoch der Mikrokern-Assay, eine zuverlässige und facettenreiche Technik, die grobe Chromosomenschäden misst9. Es handelt sich um eine Goldstandardtechnik, die von der OECD-Testleitlinie 487 zur Beurteilung von In-vitro-DNA-Schäden und Genotoxizität beschrieben wird, und ist Teil der Prüfbatterieanforderung für die regulatorische Risikobewertung10,11.
Die humane hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie, HepG2, wird häufig für das erste Risikobewertungsscreening verwendet, da die Zellen leicht verfügbar, relativ kostengünstig zu beschaffen, einfach zu kulturierbar und für ein Durchsatzscreening12,13zugänglich sind. Wenn sie in 3D-Sphärische Strukturen kultiviert werden, haben sie gezeigt, dass sie die Mikroumgebung der Leber gut rekapitulieren und ein Lebermodell mit ausreichenden proliferativen Fähigkeiten bieten, um den Mikrokern-Assay3zu unterstützen. Die Weiterentwicklung der HepG2-Sphäroidmodelle wurde etabliert, um die Langlebigkeit und Leber-ähnliche Funktionalität des Modells zu verbessern, um die Bewertung der Genotoxizitätsgefährdung über langfristige, wiederholte Expositionsregime (≤14 Tage) zu unterstützen. Daher wurde das vorliegende Protokoll gemäß den Grundsätzen der 3Rs, die Tierversuche ersetzen, reduzieren und verfeinern sollen, eingeführt, um ein fortschrittliches 3D-In-vitro-Hepatikmodell bereitzustellen, das in der Lage ist, mehrere toxikologische Endpunkte (z. B. Leberfunktionalität, (Pro-)Entzündungsmarker, Zytotoxizität und Genotoxizität) nach akuten, langfristigen und wiederholten chemischen und ENM-Expositionen routinemäßig und leicht zugänglich zuverlässig zu bewerten.
Hier stellen wir eine Methode zur Etablierung eines physiologisch relevanten 3D-Hepatozyten-Zelllinien-basierten In-vitro-Modellsystems zur Bewertung der Genotoxizitätsgefährdung nach akuten oder langfristigen, wiederholten ENM-Expositionen vor. Das Protokoll kann in 6 Schlüsselstufen unterteilt werden: Kultivierung kryokonservierter HepG2-Zellen; HepG2 Sphäroid Vorbereitung; HepG2 Sphäroid Transfer von hängenden Tropfen zu Agarose Suspension; HepG2 Sphäroid Ernte; Mikrokern-Assay und Scoring; datenanalyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Aufgrund der schnellen Entwicklung und Implementierung einer Vielzahl von technischen Nanomaterialien (ENM) ist eine Exposition gegenüber ENM unvermeidlich und die Entwicklung robuster, prädiktiver In-vitro-Testsysteme ist unerlässlich. Die Hepatische Toxikologie ist der Schlüssel bei der Betrachtung der ENM-Exposition, da die Leber eine wichtige Rolle bei der metabolischen Homöostase und Entgiftung spielt und ein wichtiger Ort der ENM-Akkumulation nach der Exposition ist. Basierend auf diesem und dem akzeptierten Verständnis, dass 2D-Hepatozytenmodelle die Komplexität komplizierter multizellulärer Wechselwirkungen und metabolischer Aktivität, die in vivo beobachtet werden, nicht genau imitieren, liegt ein größerer Fokus auf der Entwicklung physiologisch relevanter 3D-Lebermodelle, die auf ENM-Gefahrenbewertungszwecke in vitro zugeschnitten sind. In Übereinstimmung mit den Prinzipien der 3Rs, um Tierversuche zu ersetzen, zu reduzieren und zu verfeinern, wurde ein 3D HepG2 Zelllinien-basiertes Lebermodell entwickelt, das ein benutzerfreundliches, kostengünstiges System ist, das sowohl erweiterte als auch wiederholte ENM-Expositionsregime (≤14 Tage) unterstützen kann. Diese Sphäroidmodelle (≥500 m Durchmesser) behalten ihre proliferative Kapazität (d. h. Zellteilungsmodelle) und können so mit dem Mikrokernassay "Goldstandard" gekoppelt werden, um die Genotoxizität in vitro effektiv zu bewerten. Ihre Fähigkeit, über eine Reihe von toxikologischen Endpunkten zu berichten (z. B. Leberfunktion, (Pro-)Entzündungsreaktion, Zytotoxizität und Genotoxizität) wurde mit mehreren ENMs sowohl in akuten (24 h) als auch in langfristigen (120 h) Expositionsregimen charakterisiert. Dieses 3D-In-vitro-Hepatikmodell kann für die Bewertung realistischerer ENM-Expositionen genutzt werden und bietet damit einen zukünftigen In-vitro-Ansatz, um die ENM-Risikobewertung routinemäßig und leicht zugänglich zu unterstützen.

Die Eignung dieses zelllinienbasierten 3D-Lebersphäroidmodells für die Langzeitkultur und die genotoxische Gefährdungsbeurteilung wurde durch die Durchführung einer Basischarakterisierung bewertet, um die Lebensfähigkeit und Leber-ähnliche Funktionalität des Modells über die Dauer von 14 Tagen in der Kultur sowie seine Anwendbarkeit für den Mikrokern-Assay zu bestimmen.
Baseline Charakterisierung des 3D HepG2 Lebersphäroidmodells Vor jeder in vitro toxikologischen Bewertung ist es wichtig zu überprüfen, ob sich die 3D HepG2 Sphäroide richtig gebildet haben, bevor der Agarosetransfer oder die chemische/ENM-Behandlung durchgeführt wurde. HepG2-Sphäroide, die mit der Hängetropfenmethode hergestellt werden, brauchen in der Regel 2 - 3 Tage nach der Aussaat (4000 Zellen/Sphäroid), um kompakte, kugelförmige Sphäroide mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 495,52 w x 482,69 m H zu bilden, wie in Abbildung 5A-5Cdargestellt. HepG2-Sphäroide, die sich richtig gebildet haben und für die in vitro toxikologische Bewertung verwendet werden können, müssen eine kompakte, kugelförmige Struktur mit einer glatten Oberfläche und ohne visuelle Projektionen aufweisen. Abbildung 5 enthält Beispiele für gute Qualität (Abbildung 5D-F) und eine schlechte Qualität (Abbildung 5G-I) Sphäroide. Letzteres sollte verworfen werden. Typischerweise bilden sich 90-95% der pro Platte gebildeten Sphäroide richtig und sind für weitere Experimente lebensfähig.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Abbildung 5: Lichtmikroskopiebilder, die die natürliche Morphologie der HepG2-Sphäroide zeigen, die über die Hangtropfenmethode gebildetwerden. (A-C) zeigen Tag 2 und (D-I) Tag 4 HepG2 Lebersphäroide nach der Aussaat. (D-F) sind Beispiele für hochwertige HepG2-Sphäroide, während (G-I) schlecht geformte Sphäroide zeigt. Alle Bilder wurden auf einem X20-Objektiv mit einem Mikroskop aufgenommen. Die Maßstabsleiste steht für 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die Lebensfähigkeit des HepG2-Sphäroids weiter zu bestätigen, kann ein farblich-ähnlicher Bromocresol Green Albumin (BCG) Assay oder Harnstoff-Assay durchgeführt werden, um deren Leber-ähnliche Funktionalität zu bewerten. Die leberähnliche Funktionalität wurde anhand des Trypan Blue Exclusion Assay über einen Zeitraum von 14 Tagen im Einklang mit der Lebensfähigkeit bewertet, um die Langlebigkeit des Lebersphäroidmodells zu bestimmen und festzustellen, ob es eine langfristige oder wiederholte ENM/chemische Risikobewertung unterstützen könnte (Abbildung 6). Die Albumin-Konzentration blieb während der gesamten Kulturperiode konstant. Die Harnstoffproduktion zeigt eine Erhöhung der Harnstoffkonzentration, die pro Sphäroid über eine Woche in der Kultur produziert wird, bevor sie am Tag 7 ein Plateau erreicht. Es ist wichtig zu beachten, dass die in den 3D HepG2 Sphäroiden produzierten Gehalte an Albumin und Harnstoff wesentlich höher sind als die in derselben Zelllinie in einem 2D-Format kultivierten. Tatsächlich betrugen die 2D-Kulturen von HepG2-Zellen, Peak-Albumin- und Harnstoffspiegeln 0,001 mg/ml bzw. 0,010 ng/l. Darüber hinaus heben die Autoren in früheren Arbeiten, die von Shah et al. unter Verwendung eines nahezu identischen HepG2-Sphäroidsystems veröffentlicht wurden, eine bemerkenswerte Verbesserung der metabolischen Aktivität (CYP1A1 und CYP1A2) in den 3D HepG2 In-vitro-Modellsystemen im Vergleich zu den 2D-kultivierten HepG2-Zellen5hervor.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Abbildung 6: 14-Tage-Basischarakterisierungsdaten für HepG2-Lebersphäroide. Nach der Übertragung von hängendem Tropfen hebt (A) die Lebensfähigkeit des HepG2 Sphäroidmodells über einen Zeitraum von 14 Tagen hervor, während (B) und (C) die leberähnliche Albumin- bzw. Harnstofffunktionalität hervorheben. Mittelwertdaten ± SEM dargestellt, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Mit der unvermeidlichen Entwicklung eines nekrotischen Kerns, einer bekannten Einschränkung von 3D-Lebersphäroidkulturen, musste die Lebensfähigkeit dieses HepG2-basierten Modells hergestellt werden, um zu zeigen, dass es in der Lage war, langfristige (5-10 Tage) Expositionsregime aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die proliferative Fähigkeit aufrechtzuerhalten, die erforderlich ist, um den Mikrokern-Assay5zu unterstützen. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass dieses 3D-Lebersphäroid-Modell über 10 Tage in der Kultur >70% Lebensfähigkeit behält. Basierend auf dieser und in Verbindung mit der anhaltenden Leber-ähnlichen Funktionalität, die während der ≥14-Tage-Kulturperiode beobachtet wurde, kann dieses 3D-Lebersphäroid-Modell so langfristige, wiederholte ENM-Expositionsregime von bis zu 10 Tagen unterstützen (d. h. bevor die Lebensfähigkeit der Sphäroide unter 70 fällt). Als Referenz wird empfohlen, dass die Albuminspiegel für HepG2-Sphäroide, die mit 4000 Zellen/Sphäroid ausgesät sind, ≥20,0 ng/L betragen sollten, während die Harnstoffproduktion ≥0,25 ng/L betragen sollte, bevor eine in vitro toxikologische Bewertung mit diesem Modell durchgeführt wird.
Genotoxizitätsbewertung von technischen Nanomaterialien Für die Genotoxizitätsbewertung wurde der Mikrokerntest verwendet, um das Vorhandensein von Mikronuklei nach akuten (24 h) und langfristigen (120 h) ENM-Expositionen zu bestimmen. Aflatoxin B1 ist ein bekanntes Leberkarzinogen16,17 und ist eine empfohlene positive Kontrolle für den Mikrokern-Assay. Optimierungsexperimente haben gezeigt, dass 0,1 M Alfatoxin B1 eine signifikante positive (≥2,0-fache Zunahme) genotoxische Reaktion in 3D HepG2 Lebersphäroide induziert und somit in jedem Mikrokern-Assay verwendet wird, der mit diesem Modell durchgeführt wird. Um die Gültigkeit der Mikrokern-Assay-Ergebnisse mit dem HepG2-Sphäroidmodell zu gewährleisten, sollte die Hintergrundmikrokernfrequenz für HepG2-Zellen, die in diesem 3D-In-vitro-Modell verwendet werden, in einem Bereich von 0,6 % – 1,2 % liegen. Infolgedessen sollte Alfatoxin B1 eine genotoxische Reaktion auslösen, die mindestens doppelt so hoch ist als die mit der Negativkontrolle gesehene; Daher sollten 0,1 M Alfatoxin B1 eine Mikronuklei-Frequenz zwischen 1,5 % – 3,0 % induzieren. Mit diesen Kontrollparametern kann die ENM-assoziierte Genotoxizität in vitro zuverlässig beurteilt werden. Auf der Grundlage der OECD-Testleitlinie 487 ist zu beachten, dass bei der Prüfung eines ENM oder einer Chemikalie die ausgewählten Konzentrationen nicht mehr als 55 % ± 5 % Zytotoxizität (angezeigt durch eine Verringerung der CPBI- oder RVCC-Werte in Bezug auf die Negativkontrolle)11induzieren sollten. Abbildung 7 zeigt die Daten, die bei der Bewertung von Aflatoxin B1 und zwei ENMs (Titandioxid (TiO2) und Splitter (Ag)) nach akuten und langfristigen Expositionen in den HepG2-Sphäroiden und anschließender genotoxischer Potenziale mit hilfe des Mikrokern-Assays generiert wurden. Beide enMs wurden bei einer akuten (24 h) Exposition und einer langfristigen Exposition (120 h) mit einer nichtzytotoxischen, niedrigen Dosis von 5,00 g/ml getestet. Ein ähnlicher Trend zur Genotoxizität sowohl bei TiO2 als auch bei Ag ENMs ist zu beobachten, wobei die erhöhte Genotoxizitätsreaktion, die nach einer 24-h-Exposition resultierte, nach einer langfristigen Exposition von 5 Tagen nicht erkennbar war. Dies trotz anhaltender Genotoxizität, die durch die Aflatoxin B1-Positivekontrolle an beiden Zeitpunkten induziert wurde.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Abbildung 7: Genotoxizitätsbewertung nach TiO2 und Ag ENM-Exposition bei HepG2-Lebersphäroiden. Genozid (Mikrokernfrequenz) Bewertung mit dem Mikrokern-Assay-Post (A) akut (24 Stunden) und (B) Langzeit-(120-Stunden)-Exposition bei 5,00 g/ml TiO2 und Ag ENM. Negativkontrolle ist nur ein Medium, während die positive Kontrolle 0,1 m Aflatoxin B1 beträgt. Mittelwertdaten (n=2) ± SD dargestellt. Bedeutung, die in Bezug auf die Negative Kontrolle angegeben ist: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

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Biotechnik

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...