Name: the dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat
Uploaded: 2016-06-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
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The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.

Alle Tierversuche wurden von der Tierpflege und Verwendung Ausschuss der Hochschule für angewandte Wissenschaft, Temasek Polytechnic genehmigt. 1. Herstellung von DMN <ol><li> Pipette 200 ul DMN (1 g / ml Stammlösung) und 19,8 ml PBS werden 10 mg / ml DMN Lösung für die Injektion herzustellen. Hinweis: DMN krebserregend ist. Verwenden Sie eine Abzugshaube, die DMN vorzubereiten und durchzuführen, um die Tier-Injektionen. </li></ol> 2. intraperitoneale Injektion von DMN <ol><li> Verwenden männliche Wistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 150-200 g. Akklimatisieren Ratten für 4 bis 7 Tage vor Beginn des Experiments. </li><li> Pflegen Ratten bei Raumtemperatur von 22 ± 1 ° C mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel-Zyklen. Geben Sie Rattenfutter und Wasser ad libitum. </li><li> Messen Sie Lebensmittel und Wasserentnahmestellen täglich. Messen Sie das Körpergewicht pro Woche. </li><li> Berechnen der Menge an DMN für jede Ratte basierend auf einer Dosis von 10 mg / kg Körpergewicht. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel to das berechnete Volumen von DMN-Lösung in die Spritze zu ziehen. </li><li> Begrenze die Ratte für die intraperitoneale Injektion 21. </li><li> Mit der Ratte richtig verhalten, führen die Nadel in den rechten unteren Quadranten des Abdomens, für die korrekte Platzierung der Nadel im Bauchraum zu überprüfen (sollte abgesaugt werden nichts) auf dem Kolben der Spritze zurückziehen und langsam DMN Lösung zu injizieren. </li><li> Wenn die Dosis von DMN verabreicht worden ist, die Nadel langsam zurückziehen und in die Kanülenabwurfbehälter entsorgt werden. </li><li> Führen Sie die intraperitoneale Injektionen von DMN für 3 aufeinanderfolgende Tage in der Woche für 4 Wochen. Verwalten Sie die Injektionen zur gleichen Zeit jeden Tag. Re-Berechnung der Dosierung basierend auf dem Körpergewicht zu Beginn jeder Woche von Injektionen. </li><li> Sammeln Sie Blut aus der Schwanzvene wöchentlich biochemische Parameter zu messen: Alanin - Aminotransferase (ALT) und Aspartat - Aminotransferase (AST) 22. </li><li> Messen Serum ALT und AST Kommerzielle Vet mitTest-Chemie Analyzer. </li></ol> 3. Brutto Prüfung und Ernte der Leber <ol><li> Euthanize die Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital bei einer Dosis von 100 mg / kg Körpergewicht. Sicherzustellen Tod durch den Mangel an Herzschlag überprüft. </li><li> Bereiten Sie sich für die post mortem und beurteilen den Zustand des Tieres , wie von Parkinson et al. 23 Platz tote Ratten auf Sezieren Bord in Rückenlage mit dem Bauch nach oben. </li><li> Desinfizieren und die Haut mit 70% Ethanol befeuchten. </li><li> Mit einer Schere einschneiden der Haut die gesamte Länge des Ventralfläche vom Anus bis zum Kinn, und die Haut zu reflektieren. Mit der Schere einschneiden die Bauchdecke aus dem Anus zu den xiphoid Knorpel, um die Bauchorgane aussetzen. </li><li> Untersuchen Sie die Bauchorgane in situ für alle Anomalien zu überprüfen. Notieren Sie alle Änderungen in Farbe, Größe, die Lage der Organe und das Vorhandensein von Flüssigkeit in der Bauchhöhle. Untersuchendie Konsistenz von Organen und beachten Sie das Vorhandensein von Gerüchen. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette, sezieren die gesamte Leber frei von seiner Bänder und Anhänge. <ol><li> Beginnen Sie an der Hilus, wo sie an der Membran angebracht ist, und arbeiten alle Leberlappen von Anhängen zu befreien. Schneiden Sie vorsichtig alle Bänder und Blutgefäße. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Leber auf eine Petrischale und wiegen die Leber. </li><li> Mit einem Skalpell geschnitten 2 bis 5 mm dicke Abschnitte von Leberlappen. Aus Gründen der Einheitlichkeit nehmen immer Proben aus dem gleichen Leberlappen. Nehmen Sie einen Keil etwa 5 mm Durchmesser in der Dicke, von der rechten Seitenlappen 24 etwa 1 cm vom Rand des lobe.Immediately Ort in 10% gepuffertem Formalin - Fixierung. Stellen Sie sicher, das Gewebe zu Formalin Volumen 1:10 oder mehr. </li><li> Ernte und sofort einfrieren Portionen (mit flüssigem Stickstoff) von Leberlappen an dieser Stelle erforderlich, wenn für andere Studien. Wie bei (3,8), Probe aus der gleichen Leberlappen für Konsistenz. </li></ol><ol><li> Fixieren die Leberproben in 10% gepuffertem Formalin für mindestens 24 Stunden. </li><li> Nach der Fixierung schneiden Sie die Leber, legen Sie in Kassetten und sie in den Korb des automatisierten Gewebeprozessor laden. </li><li> Platzieren Sie den Korb mit Kassetten in die erste Station, die 10% gepuffertem Formalin enthält. Achten Sie darauf, die Kassetten vollständig unter Wasser. Sie kann für bis zu 12 Stunden in dieser Kammer bleiben, bis der Zyklus beginnt. </li><li> Programmieren Sie die Gewebeprozessor die Kassetten für 1 Stunde jeden, durch aufeinanderfolgende Stationen mit den folgenden Lösungen zu drehen: Ethanol in einer Konzentration von 50%, 70%, 90%, 100% (2 Stationen), Xylol (2 Stationen) und flüssiges Paraffin ( 2 Stationen). </li><li> Übertragen Sie die Leberproben in das Wachsbad des Einbettungsstation. Sicherzustellen, daß die Einbettungsmaschine auf mindestens eine Stunde früher umgeschaltet wird. </li><li> Mit vorgewärmten Zange (65 ° C), nehmen Sie jede Kassette aus dem wax Bad und Platz auf der warmen Platte (65 ° C) des Einbettungs Maschine. Dispense ausreichende Menge an flüssigem Paraffin in den Edelstahlbasisform (vorgewärmt auf 65 ° C) bis halb voll. Übertragen Sie den Abschnitt der Leber aus der Kassette in die Form. Sicherstellen, dass die Probe mit der Schnittfläche platziert flach auf den Boden der Form (werden mikroskopisch untersucht). </li><li> Füllen Sie die Form vollständig mit flüssigem Paraffin, montieren Sie die leere Kassette auf und legen Sie die Form auf die 4 ° C-Platte des Einbettungs Maschine für mindestens 30 Minuten abkühlen lassen. </li><li> Überprüfen Sie, ob das Wachs abgekühlt und verfestigt wird, und entfernen Sie den Paraffinblock aus der Form. Der Block sollte sich leicht herausspringen und nicht kleben oder zu knacken. Wenn dies geschieht, schmelzen den Block und diesen Schritt wiederholen. Der Paraffinblock kann geschnitten werden, sobald es erstarrt. Blöcke können bei Raumtemperatur für viele Jahre gelagert werden. </li><li> Platzieren Sie den Paraffinblock in dem Mikrotom und Abschnitt bei 10 &amp; mgr; m Dicke, bis die Wachsschichtausreichend für die eingebettete Lebergewebe sichtbar sein wird entfernt. </li><li> Ändern Sie die Einstellung auf dem Mikrotom bei 5 &amp; mgr; m Dicke zu schneiden. Mit einer Pinzette, holen einen gut Abschnitt geschnitten, indem sie am Rand festhalten und sorgfältig den Abschnitt im Wasserbad schwimmen bei einer Temperatur von 40 ° C. </li><li> Sanft legen Sie einen sauberen Glasobjektträger unter dem schwimmenden Abschnitt und heben Sie sie auf die Oberfläche des Glasträger. Legen Sie die Folie auf eine Folie wärmer bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 5. Masson Trichromfärbung <ol><li> Bevor die Flecken anwenden, behandeln Sie die Folien um das Wachs zu entfernen und das Gewebe rehydrieren wie folgt: <ol><li> Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol für 5 min. Repeat 2x. </li><li> Tauchen Sie die Abschnitte in 100% Ethanol für 3 min. Wiederholen 1x. </li><li> Tauchen Sie die Abschnitte für jeweils 1 min in den folgenden Lösungen von Ethanol: 90%, 80% und 70%. </li></ol></li><li> Spülen Sie die Folie unter fließendem Wasser zu entfernen alle vorhandenen Ethanol auf der Folie. </li><li> Tauchen Sie Dias in Eisen-Hämatoxylin für 10 Minuten in den Zellkern zu färben. </li><li> Spülen Sie die Folien mit Wasser, um den überschüssigen Farbstoff aus der Folie zu entfernen. </li><li> Tauchen Sie die Folien in Biebricher Scharlach-Säurefuchsin für 2 Minuten in das Zytoplasma zu färben. </li><li> Spülen Sie die Folien mit Wasser. </li><li> Legen Sie die Folien in Phosphorwolfram / Phosphomolybdänsäure-Lösung für 10 min, um die Aufnahme von Anilinblau zu fördern. Ändern Sie die Phosphorwolfram / Phosphomolybdänsäure Lösung nach 2 Runden Einsatz. </li><li> Legen Sie die Folien in Anilin-Blau-Lösung für 10 min die Kollagenfasern zu färben. </li><li> Spülen Sie das überschüssige Fleck mit Wasser und legen Sie die Folien in 1% ige Lösung Essigsäure für 1 min Differenzierung stattfinden kann die Farbe des Schiebers mehr zart und transparent zu machen. </li><li> Spülen Sie die Folien mit Wasser und füllen Sie die Gewebeschnitte zu entwässern. Die Dehydratisierung Schritte sind wie folgt: </li><li> Eintauchen der Objektträger nacheinander 10 Sekunden lang jedes Mal in der folgenden concentrations Ethanol: 70%, 80%, 95% und 100%. </li><li> Eintauchen der Objektträger für 30 Sekunden in 100% igem Ethanol. Wiederholen 1x. </li><li> Spülen Sie die Folien durch 3 Stationen Xylol für jeweils 5 min Ethanol zu entfernen. </li><li> Montieren Sie einen Deckglas auf die Probe mit Montage Medien (zB DPX mountant) und trocknen lassen. Hinweis: DPX ein synthetisches Harz ist, das schnell trocknet, bewahrt Fleck und schützt den Gewebeschnitt. </li></ol> 6. Fibrosis Punkten auf Massons Trichom Gefärbte Schnitte von Leber <ol><li> Haben Sie einen Veterinär - Pathologe beurteilen die Schwere der Fibrose nach der Fibrose 25 punkten. Es wäre optimal, wenn die Fibrose scoring durch zwei oder drei unabhängig Pathologen in verblindet Weise durchgeführt wird. In einem solchen Szenario eine Endnote nach Diskussion und Gruppen Bewertung zu sortieren, alle Unterschiede in Scoring erhalten. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ergebnis </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Keine Fibrose </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Faserige Expansion einiger Portalbereiche mit oder ohne kurze Bindegewebssepten </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Faserige Expansion der meisten Portalbereiche mit oder ohne kurze Bindegewebssepten </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Faserige Expansion der meisten Portalbereiche, gelegentliche Portal zum Portal (PP) überbrück </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Faserige Ausbau der Portalbereiche mit markierten Bridging (Portal zu Portal (PP) sowie Portal zentrale (PC) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> So bezeichnete Bridging (PP und / oder PC) mit gelegentlichen Knötchen (unvollständige Zirrhose) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Zirrhose, wahrscheinlich oder sicher </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fibrose - Score 25 verwendet die Massons Trichom Stained Leberschnitten für das Lesen.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben ein Verfahren beschrieben, ein Tiermodell der Leberfibrose zu machen und die Schwere der Leberfibrose zu beurteilen. Es ist wichtig, die richtige Dosis von DMN und sich an den Zeitplan für die wöchentliche intraperitoneale Injektionen zu liefern. Als das Experiment fortschreitet, ist es entscheidend, die Ratten und neu zu berechnen, um die Dosis zu Beginn jeder Woche der DMN-Injektionen zu wiegen. Beachten Sie, dass DMN giftig ist, und muss in der Abzugsschrank behandelt werden. Wir führen die intraperitone...

DMN ist ein potenter leberspezifischen Toxin. Den Stoffwechsel, die Gewebeverteilung und die Fähigkeit , Verletzungen der Leber von Ratten zu verursachen wurde von Magee 1 ist , und der Mechanismus der Hepatozyten - Schädigung und Zelltod durch Apoptose berichtet wurde von Pritchard und Butler 2 beschrieben. Intermittierende Verabreichung dieser Verbindung wurde berichtet , dass Leberfibrose in Ratten , Hunden und 3,4 induzieren. Die Mechanismen und morphologischen Veränderungen der Leberfibrose wurden unter Verwendung dieses Modells ausführlich untersucht. In frühen Studien , die die Ratte mit 3-wöchigen Behandlung mit DMN produziert Nekrose zentrilobuläre hämorrhagischen gefolgt von micronodular Zirrhose ohne Steatose 5. Es wurde , dass in der frühen Fibrose gezeigt, gebildet wurde , war das Kollagen mehr Kreuz mit Typ verknüpft III mehr im Vordergrund ist als Typ - I - 6. Gemeinsam mit anderen Ursachen, DMN induzierte fibrotische Veränderungen wurden mit einem Anstieg in Kupffer-Zellen verbunden sind; Leber Makrophagen, die ich wohnenn die Sinusoide. Diese Zellen verwandeln sich in Myofibroblasten und produzieren große Mengen an extrazellulären Matrix , die das primäre Problem in Fibrose ist 7. Hinsichtlich zellulärer Signal, Nakamura et al. Gezeigt , dass TGF-β eine kritische Rolle bei der Progression der Leberfibrose 8 spielt. Sie verwendeten ein Adenovirus ein verkürztes Typ II TGF-β-Rezeptor exprimieren, spezifisch zu TGF-β-Signalisierung inhibieren. Leberfibrose bei diesen Ratten wurde spektakulär während DMN Behandlung angehalten, wenn zu den Kontrollgruppen verglichen. Andere Studien haben bestätigt , dass die Unterdrückung von TGF-β führt zur Linderung von Leberfibrose Entwicklung 9,10. Das Modell wurde auch in einer globalen Gen Profilierungs Studie verwendet , um andere fibrosis Marker und Proteine ​​zu identifizieren , die als Arzneimittelziele für anti-fibrotische Therapie 11 verwendet werden könnten. Andere chemische Mittel verwendet Leberfibrose zu induzieren umfassen Thioacetamid (TAA) und cArbon Tetrachlorid (CCl 4). TAA wurde zuerst bei Ratten verwendet und später in Mäusen 12. Die Vorteile dieses Modells sind: einfache chemische Verabreichung im Trinkwasser, die Reproduzierbarkeit des Modells mit charakteristischen micronodular Zirrhose und biochemische Veränderungen. Die Nachteile umfassen: die lange Zeitdauer von 3 Monaten bei Leberfibrose zu entwickeln, und der Mangel an Verständnis des molekularen Mechanismus zur Induktion von Leberfibrose. Wie für CCl 4, deren Verwendung aus den folgenden Gründen abgelehnt hat: es ist nicht die menschliche Lebererkrankung nachahmt, hat schädliche Auswirkungen auf die Ozonschicht verursacht Schmerzen und Leiden für die Tiere, ist sehr giftig für Menschen und erfordert zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen in der Handhabung und Entsorgung 13,14. Längerer Gallengangaufstau (durch einen chirurgischen Eingriff) als ein experimentelles Modell für die Leberzirrhose wurde zuerst von Kountouras et al. 15. Diese Methode ist nicht-toxisch für Menschen und Tiere. However, die Zeit für Leberfibrose erforderlich variiert zu entwickeln. Eine Überprüfung von 30 Berichte von Marques et al. 16, festgestellt , dass es von 7 Tage bis vier Wochen nach der Operation nahm für Leberfibrose zu entwickeln. Die pathologischen Veränderungen beschrieben imitieren die der menschlichen chronischen biliären Fibrose und das Modell für die Forscher interessiert in diesem Bereich besser geeignet wäre. Zusammenfassend erzeugt die intermittierende Verabreichung einer konstanten Dosis von DMN in der Ratte über 4 Wochen Leberfibrose, die die menschliche Erkrankung imitiert. Dosierte Ratten zeigen fortschreitende Entwicklung von Leberschäden und parenchymal Fibrose 4,17. Der Verlauf der Erkrankung und der Schwere kann über Blutproben oder Opfer von Tieren zu bestimmten Zeitpunkten überwacht werden und der Effekt ist sehr gut reproduzierbar 18. Damit das Modell für potentielle anti-fibrotische Mittel 10,19,20 weithin verwendet , um die Mechanismen der Leberfibrose und Leberzirrhose zu studieren sowie zu screenen ist.

<table><tbody><tr><td>Dimethylnitrosamine</td><td>Wako</td><td>147-03781</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sinopharm chemicals</td><td>F63257009</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Masson trichome stains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aniline Blue</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#42755</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuschin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT42685</td><td></td></tr><tr><td>Scarlet Red</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#26905</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>ALFA AESAR</td><td>ALFA40116.4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphomolybdic Acid Hydrate</td><td>Sigma SG</td><td>221856-25G</td><td></td></tr><tr><td>Weigert&#039;s Iron Hematoxilyn</td><td>Merck</td><td>1.15973.0002</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>Merck</td><td>HX066873</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Leica</td><td>Leica TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Embedding machine</td><td>Sakura</td><td>&amp;nbsp;Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>Leica RM 2235</td><td></td></tr><tr><td>Vet Test Analyzer</td><td>Idexx</td><td>Vet Test 8008</td><td></td></tr></tbody></table>

the dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat

Vier bis sechs Wochen alte, männliche Wistar-Ratten wurden verwendet, Tiermodellen der Leberfibrose zu erzeugen. Das Verfahren erfordert vier Wochen nach der Verabreichung von 10 mg / kg Dimethylnitrosamin (DMN), intraperitoneal für drei aufeinanderfolgende Tage pro Woche. Die intraperitoneale Injektionen wurden im Abzug durchgeführt, wie DMN ein bekanntes hepatoxin und karzinogen ist. Das Modell hat mehrere Vorteile. Zum einen kann Leberveränderungen sequentiell oder in bestimmten Stadien von Interesse untersucht werden. Zweitens kann das Stadium der Lebererkrankung, die durch Messung von Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) Enzyme überwacht werden. Drittens kann die Schwere von Leberschäden in verschiedenen Stadien durch Opferung von Tieren zu bestimmten Zeitpunkten, gefolgt von histologischen Untersuchung von Masson gefärbt Trichome Lebergewebe bestätigt. Nach vier Wochen DMN Dosierung ist die typische Fibrose-Score 5 bis 6 auf dem Ishak Maßstab. Das Modell kann konsequent reproduziert werden und hatweithin verwendet, um die Wirksamkeit von potentiellen anti-fibrotische Mittel zu bewerten.

DMN behandelten Ratten, Gewicht zu verlieren und weniger kräftig mit gekräuselten Haarmantel. Es gibt einen signifikanten Verlust der durchschnittlichen Körpergewicht von DMN behandelten Ratten; erste nachweisbare nach 2 Wochen der Behandlung DMN, und dieser Unterschied ist noch durch Wochen 3 und 4 nach DMN Behandlung (Abbildung 1a). Als die Ratten DMN über aufeinanderfolgende Wochen erhalten, Schädigung der Leber bewirkt, dass es kleiner wird. Die Leber-Index; Das...

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The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Die Dimethylnitrosamin Induced Liver Fibrosis Modell in der Ratte

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.0K Aufrufe.  Temasek Polytechnic. We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Serie: The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS Colitis-Modelle: Einblicke in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Effekte von Nahrungsfett

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Medizin

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Immunologie und Infektion

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Biotechnik

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has hindered the development of a preventative drug. Primarily, finding a suitable animal model is challenging in understanding the mechanism of Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis pathology. Here, we adopted an effective method where TNBS chemical exposure to mice rectums produces substantially deep ulceration and chronic inflammation, and the mice then chronically develop intestinal fibrosis. Also, we describe a technique where a rapamycin injection shows inhibitory effects on TNBS-mediated fibrosis in the mouse model. To assess the underlying mechanism of fibrosis, we methodically discuss a procedure for purifying Cx3Cr1+ cells from the lamina propria of TNBS-treated and control mice. This detailed protocol will be helpful to researchers who are investigating the mechanism of fibrosis and pave the path to find a better therapeutic invention for Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis.

In this study, we describe a detailed procedure of TNBS-mediated intestinal fibrosis, which exhibits comparable pathophysiology to Crohn&#39;s fibrosis. We also discuss this approach in light of rapamycin facilitated inhibitory effects on intestinal fibrosis.

Mechanistische Einblicke in die Entwicklung von TNBS-vermittelter Darmfibrose und Bewertung der hemmenden Wirkungen von Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and detoxifying functions of the liver. In most irreversible liver damage cases, orthotropic liver transplant (OLT) remains the only available treatment. To study the therapeutic potential of a treatment for ALF, its prior testing in an animal model of ALF is essential. In the current study, an ALF model in rats was developed by combining 70% partial hepatectomy (PHx) and injections of acetaminophen (APAP) that provides a therapeutic window of 48 h. The median and left lateral lobes of the liver were removed to excise 70% of the liver mass and APAP was given 24 h postsurgically for 2 days. Survival in ALF-induced animals was found to be severely decreased. The development of ALF was confirmed by altered serum levels of the enzymes alanine amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), alkaline phosphatase (ALP); changes in prothrombin time (PT); and assessment of the international normalized ratio (INR). Study of the gene expression profile by qPCR revealed an increase in expression levels of genes involved in apoptosis, inflammation, and in the progression of liver injury. Diffused degeneration of hepatocytes and infiltration of immune cells was observed by histological evaluation. The reversibility of ALF was confirmed by the restoration of survival and serum levels of ALT, AST, and ALP after intrasplenic transplantation of syngeneic healthy rat hepatocytes. This model presents a reliable alternative to the available ALF animal models to study the pathophysiology of ALF as well as to evaluate the potential of a novel therapy for ALF. The use of two different approaches also makes it possible to study the combined effect of physical and drug-induced liver injury. The reproducibility and feasibility of current procedure is an added benefit of the model.

The acute liver failure animal model developed in the current study presents a feasible alternative for the study of potential therapies. The current model employs the combined effect of physical and drug-induced hepatic injury and provides a suitable time window to study the potential of novel therapies.

Generierung eines Rattenmodells für akutes Leberversagen durch Kombination von 70% partieller Hepatektomie und Acetaminophen

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Biologie

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role of nicotine, the primary addictive ingredient in cigarettes, in silicosis development is unclear. The mouse model employed in this study was simple and easily controlled, and it effectively simulated the effects of chronic nicotine ingestion and repeated exposure to silica on lung fibrosis through epithelial-mesenchymal transition in human beings. In addition, this model can help in the direct study of the effects of nicotine on silicosis while avoiding the effects of other components in cigarette smoke.
After environmental adaptation, mice were injected subcutaneously with 0.25 mg/kg nicotine solution into the loose skin over the neck every morning and evening at 12 h intervals over 40 days. Additionally, crystalline silica powder (1-5 &#181;m) was suspended in normal saline, diluted to a suspension of 20 mg/mL, and dispersed evenly using an ultrasonic water bath. The isoflurane-anesthetized mice inhaled 50 &#181;L of this silica dust suspension through the nose and were awoken via chest massage. Silica exposure was administrated daily on days 5-19.
The double-exposed mouse model was exposed to nicotine and then silica, which matches the exposure history of workers who are exposed to both harmful factors. In addition, nicotine promoted pulmonary fibrosis through epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in mice. This animal model can be used to study the effects of multiple factors on the development of silicosis.

This study describes a mouse model to study the synergistic effect of nicotine on the progression of pulmonary fibrosis in experimental silicosis mice. The dual-exposure mouse model simulates the pathological progression in the lung after simultaneous exposure to nicotine and silica. The methods described are simple and highly reproducible.

Verwendung von Nikotin in einem Kieselsäure-exponierten Mausmodell zur Förderung des Übergangs von Lungenepithel zu mesenchym

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role ...