Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den mitochondrialen Energiestoffwechsel und nahtlose Sphäroide zu untersuchen, um Vergleiche zwischen verschiedenen Zelllinien, Zellzahlen und Phänotypen sowie medikamentöse Behandlungen in einer Reihe von Feldwirkstoffen und Krebsforschung zu ermöglichen. Unsere Arbeit präsentiert ein detailliertes Protokoll zur Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels unter Verwendung von 3D-Sphäroiden, die das überlegene physiologische Modell im Vergleich zu Zellmonoschichtexperimenten bieten. Biologische Beobachtungen könnten von glasigen Sphäroiden auf In-vivo-Tumore extrapolieren und Wege identifizieren, die auf den Sphäroidtumorstoffwechsel abzielen können.
Zum Beispiel Kohlenhydrat-Nutzen während des Sphäroidwachstums. Alle Daten seahorse extracellular flux 96 Instrument ist sehr empfindlich. Die Positionierung von In-vitro-Sphäroiden innerhalb der Assay-Platte ist von größter Bedeutung, um genaue Daten auf der Ebene des Einzelsphäroids zu erhalten.
Überprüfen Sie die Sphäroidlebensfähigkeit mit einem inversen Lichtmikroskop mit Phasenkontrast bei 4-facher Vergrößerung, um eine intakte Sphäroidstruktur, Morphologie und allgemeine Gleichmäßigkeit zwischen den Proben zu gewährleisten. Um die Sensorpatrone mit Feuchtigkeit zu versorgen, aliquotieren Sie etwa 20 Milliliter des Kalibrats in ein konisches Rohr. Legen Sie das konische Rohr mit dem Kalibrant über Nacht in einen kohlendioxidfreien 37 Grad Celsius-Inkubator.
Nehmen Sie den Inhalt des Assay-Kits heraus. Legen Sie die Sensorkassette kopfüber neben die Gebrauchsplatte. Pipetten Sie 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser mit einer Mehrkanal-P300-Pipette in jede Vertiefung der Gebrauchsplatte.
Legen Sie die Sensorkassette auf die Utility-Platte. Überprüfen Sie, ob der Wasserstand in jedem Brunnen hoch genug ist, um die Sensorsonden einzutauchen. Die montierte Sensorkartusche in einen kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator geben und über Nacht stehen lassen.
Um die Sphäroid-Assay-Mikrotiterplatte zu beschichten, fügen Sie 30 Mikroliter sterile 0,1 Milligramm pro Milliliter Poly-D-Lysin-Lösung pro Vertiefung der Sphäroid-Mikrotiterplatte unter Verwendung einer septischen Technik hinzu. Saugen Sie die Lösung aus jeder Vertiefung der Sphäroid-Mikrotiterplatte ab, invertieren Sie die Platte und klopfen Sie sie fest auf Seidenpapier, um die Restlösung zu entfernen. Waschen Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern sterilem doppelt destilliertem Wasser.
Kehren Sie nach der letzten Wäsche die Mikrotiterplatte um und klopfen Sie sie fest auf Seidenpapier, um Restwasser zu entfernen. Lassen Sie die Platte 30 Minuten an der Luft trocknen, bevor sie später verwendet wird. Bereiten Sie das XF RPMI-Medium wie im Manuskript beschrieben vor.
Vorwärmen Sie den ergänzten XF RPMI Assay eine Stunde vor dem Assay auf 37 Grad Celsius vor. Und wärmen Sie die beschichtete Sphäroid-Assay-Mikroplatte in einem kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator vor. Nehmen Sie das konische Rohr mit dem Kalibrant und der Sensorpatrone aus dem Luftinkubator.
Entfernen Sie die Sensorkassette von der Gebrauchsplatte und legen Sie sie kopfüber auf die Arbeitsfläche. Saugen Sie mit einer P300-Mehrkanalpipette das Wasser von der Utility-Platte ab und entsorgen Sie es. Fügen Sie 200 Mikroliter des vorgewärmten Calibrants zu jeder Vertiefung der Gebrauchsplatte hinzu.
Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte, um sicherzustellen, dass die Sensoren gut in das Kaliber eingetaucht sind. Überführen Sie die zusammengebaute Sensorkartusche in den kohlendioxidfreien 37-Grad-Inkubator, bis sie bereit ist, die Anschlussinjektionslösungen zu laden. Nehmen Sie die Sphäroidkulturplatte aus dem Inkubator und beobachten Sie die Sphäroide unter dem Mikroskop, um ihre Integrität vor dem Sphäroidtransfer sicherzustellen.
Laden Sie 180 Mikroliter vorgewärmtes Assay-Medium in jede Vertiefung der Sphäroidplatte, einschließlich aller Hintergrundkorrekturvertiefungen. Eine sieben Zentimeter große Petrischale teilweise mit drei Millilitern des Assay-Mediums füllen. Übertragen Sie die Sphäroide von der 96-Well-Kulturplatte in eine Petrischale mit einer Mehrkanalpipette, die mit breiten Pipettenspitzen beladen ist, und das Volumen ist auf 10 bis 50 Mikroliter eingestellt.
Stellen Sie das Volumen eines Einkanalpipettors mit einer breiten Pipettenspitze auf 20 Mikroliter ein und saugen Sie vorsichtig einen einzelnen Sphäroid ab. Platzieren Sie die Spitze direkt in der Mitte jeder Vertiefung dieser Sphäroid-Assay-Mikroplatte und lassen Sie die Kapillarwirkung zu, um das Sphäroid aus der Pipettenspitze zurückzuziehen. Bestätigen Sie die Entwicklung unter dem Mikroskop, indem Sie den Inhalt des Pipettierers in die Petrischale zurückpipettieren.
Sobald alle diese Sphäroide auf die Sphäroid-Assay-Mikroplatte übertragen wurden, übertragen Sie die Platte für mindestens eine Stunde in einen Nicht-Kohlendioxid-Inkubator von 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Arbeitsstoffkonzentrationen jeder Verbindung wie im Manuskript beschrieben unter Verwendung eines vollständig ergänzten vorgewärmten XF RPMI-Assay-Mediums vor. Dosierte 20 Mikroliter der Arbeitslösung jeder Verbindung in alle entsprechenden Ports mit einer kalibrierten P100-Mehrkanalpipette.
Bereiten Sie den Analysator für das Laden der Sensorpatrone vor. Um wohlgeformte kompakte Sphäroide zu erhalten, wurde jede Zelllinie einzeln für die Aussaatdichte und die Kultivierungsdauer optimiert. Bei optimierten Seeding-Strategien betrug das Sphäroidvolumen für SK-OV-3 etwa 5,46 x 10 bis zu den sieben Mikrometern und für A549 1,45 x 10 bis acht Mikrometer gewürfelt.
Alle Sphäroidtypen hatten eine lineare Korrelation zwischen der anfänglichen Aussaatdichte und dem Sphäroidvolumen. Die perfekte Sphäroidsymmetrie hatte eine Zirkularität von 1,0 und eine Abweichung von 1,0 deutete auf einen Verlust der Zirkularität hin. Für alle Sphäroidtypen stieg die Sauerstoffverbrauchsrate mit der Sphäroidgröße an und korrelierte linear mit dem Sphäroidvolumen mit dem höchsten in MCF-7-Sphäroiden und dem niedrigsten in SK-OV-3-Sphäroiden.
MCF-7-Sphäroide reagierten während des gesamten Experiments nicht auf die Fahrzeugsteuerung. Die Sauerstoffverbrauchsrate in MCF-7-Sphäroiden wurde mit Oligomycin nach fünf Messzyklen nach der ersten Injektion von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter gesenkt. Als Reaktion auf BAM15 wurde der Sauerstoffverbrauch vor der zweiten Injektion erhöht.
Während die Kombination von Rotenon plus Antimycin A es senkte. Ein Protokoll zur genauen Untersuchung der basalen mitochondrialen Atmung. ADP-Phosphorylierungsatmung, Leckatmung, Kopplungseffizienz, maximale Atmungskapazität und freie Atmungskapazität wurden unter Verwendung von krebsabgeleiteten 3D-Sphäroiden entwickelt.
Alle respiratorischen Verbindungen ergaben die erwarteten kinetischen Sauerstoffverbrauchsraten für die ausgewählten Verbindungen, die eine durchschnittliche stetige basale Atmungsrate von 20 bis 30 Picomol Sauerstoff pro Minute und Bohrloch zeigten. Lage der Sphäroide innerhalb der Mikrotiterplatte und Messzyklusnummer nach der Injektion der Verbindung, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenzen zwischen den Zugabe von Verbindungen stabil sind. Bei der Erforschung der mitochondrialen Atmungskapazität mit Entkopplern ist nicht nur die Konzentration entscheidend, sondern auch ihre Fähigkeit, die Atmung in Gegenwart von Oligomycin zu entkoppeln, das typischerweise vor dem Entkoppler in Experimenten zur Untersuchung des mitochondrialen Energiestoffwechsels hinzugefügt wird.
