NASH ist eine der wichtigsten chronischen Lebererkrankungen der Welt. Es kann zu Fibrose, Leberzirrhose und schließlich Leberkrebs führen. Die Untersuchung der dynamischen Veränderung der EZM im NASH kann helfen, die Fibrose besser zu verstehen.
Herkömmliche Bildgebung kann keine 3D-EZM-Strukturveränderungen darstellen, was das Verständnis des dynamischen EZM-Umbauprozesses in der Leberfibrose einschränkt. Wiegen Sie zunächst die Maus vor dem Eingriff. Nach der Betäubung der Maus rasieren Sie den Bauchbereich mit einer Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie die Haut mit 70%igem Ethanol.
Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Beine mit Klebeband auf dem chirurgischen Brett. Verwenden Sie eine Mayo-Schere und eine Adson-Pinzette, um einen drei Zentimeter langen Schnitt seitlich in den Unterbauch zu machen. Und dann ein fünf Zentimeter langer Schnitt senkrecht vom Unterbauch bis zum Processus xiphoideus, ohne die Brusthöhle zu öffnen.
Nachdem Sie das Bauchfell geöffnet haben, platzieren Sie den Darm vorsichtig links vom Tier und heben Sie den rechten Leberlappen mit einem Viskoseapplikator an, um die Pfortader freizulegen. Um die Pfortader zu katheterisieren, wird ein 24-Gauge-IV-Katheter in das distale Ende der Pfortader eingeführt. Setzen Sie die Katheterspitze an, bevor sich die Pfortader in die Leberlappen verzweigt.
Ziehen Sie die Nadel sofort zurück, wenn der Katheter in die Vene eintritt. Überprüfen Sie, ob der Katheter richtig in der Vene positioniert ist, indem Sie die Leber mit einer Ein-Milliliter-Spritze über den Katheter mit PBS durchbluten. Verwenden Sie eine Dumont-Mikrozange, eine Castroviejo-Mikronadel und eine 4-0-Naht, um einen Stich unter der Verzweigung der Pfortader und einen zweiten Stich einen Zentimeter darunter zu platzieren, um den Katheter zu sichern.
Verbinden Sie den Katheter mit einem Köderanschluss mit einem Silikonschlauch von einem Meter Länge, drei Millimeter Innendurchmesser und 4,1 Millimeter Außendurchmesser. Schließen Sie den Silikonschlauch an eine Schlauchpumpe und einen Behälter mit deionisiertem Wasser an. Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen im Inneren des Röhrchens und vermeiden Sie die Bildung neuer Blasen während der Perfusion.
Stellen Sie die Schlauchpumpe auf eine Förderleistung von 0,2 Millilitern pro Minute ein. Zuerst zwei Stunden lang mit deionisiertem Wasser betrachten, ändert sich die Farbe der Leber während der Perfusion von rot zu gelb. Stellen Sie die Perfusionslösung auf 0,5%iges Natriumdesoxycholat um und fahren Sie über Nacht fort, und die Leber wird am Ende der Perfusion weiß.
Schalten Sie die Perfusionslösung auf deionisiertes Wasser um und durchbluten Sie sie zwei Stunden lang. Verwenden Sie eine Dumont-Mikrozange und eine Mikro-Federschere, um die dezellularisierte Leber zu sammeln und sie vorsichtig in einer Petrischale mit PBS zu waschen. Übertragen Sie ein kleines Stück dezellularisierter Leber auf einen Objektträger und legen Sie das Gewebe in die Mitte.
Geben Sie 10 Mikroliter Antifade-Eindeckmittel mit einer Pipette in das Gewebe, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden. Decken Sie das Gewebe mit einem Deckglas ab und üben Sie eine kleine Kraft aus, um die Probe zu glätten. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit farblosem und transparentem Nagellack.
Geben Sie einen Tropfen eines Immersionsöls auf die Oberseite des Deckglases und legen Sie den Objektträger auf den Objektträgerhalter. Senken Sie die 20-fache Ölobjektivlinse ab, bis sie das Immersionsöl berührt. Wechseln Sie in den violetten Kanal mit einer Wellenlänge von 405 Nanometern.
Schalten Sie den Verschluss ein und fokussieren Sie die Probe. Navigieren und positionieren Sie den Interessenbereich für die Bildgebung. Schalten Sie den Verschluss aus, bevor Sie mit der Bildaufnahme mit Laserlicht fortfahren.
Um den Zwei-Photonen-Laser zu starten, wechseln Sie zur Computersteuerung und schalten Sie zuerst den Zwei-Photonen-Laser ein. Schalten Sie dann den Zwei-Photonen-Lasercontroller und den Verschluss ein und stellen Sie sicher, dass die Ausgangsleistung höher als 2,5 Watt ist. Reduzieren Sie die Laserleistung, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern.
Wählen Sie die Detektoren aus und passen Sie sie sowohl für Photomultiplikatoren als auch für den Hybrid an, um die ausgewählten Fluorophore aufzunehmen. Wählen Sie zwischen simultanen oder sequenziellen Bildaufnahmen. Stellen Sie die Lochblende auf den höchsten Wert ein.
Passen Sie Laserwellenlängen, Verstärkung, Leistung, Versatz der Pixelverweildauer, Mittelung der Pixelgröße und Zoom an. Scrollen Sie mit dem Z-Controller des Computers und stellen Sie die Z-Abmessungen ein. Definieren Sie den Start- und Endpunkt und wählen Sie die Anzahl der Bilder aus, die innerhalb eines Volumes angegeben werden.
Erfassen Sie Bilder. Nach der Durchführung der Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigten Kollagenfasern ohne Dezellularisierung ein niedrig aufgelöstes Bild des Kollagennetzwerks. In der dezellularisierten extrazellulären Matrix wurden offensichtliche Unterschiede in der Morphologie und räumlichen Verteilung zwischen Chow- und Fast-Food-Diätlebern beobachtet.
Kollagenfasern und Mäuse, die eine Chow-Diät erhielten, zeigten ein verwobenes und gut organisiertes Netzwerk, während die Mäuse mit Fast-Food-Diät Kollagenbündel mit geringerer Konnektivität aufwiesen. Die dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix der Leber zeigt, dass die Kollagenfasern bei Mäusen mit Chow-Diät ein gut organisiertes Netzwerk aufwiesen, nicht jedoch bei Fast-Food-Diät-Mäusen. Um die Qualität des fibrillären Kollagens in der dezellularisierten extrazellulären Matrix zu bestätigen, wurden die Objektträger mit Hämatoxylin, Eosin und Picrosiriusrot gefärbt.
Hämatoxylin und Eosin zeigen, dass alle Zellen entfernt wurden. In den Bildern der Picrosirius-Rotfärbung zeigte die extrazelluläre Matrix der mit Chow gefütterten Mäuse ein gut organisiertes Netzwerk. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit Fast-Food-Diät dichtere Kollagenfasern.
Entfernen Sie vorsichtig die Blase in einem Röhrchen vor der Perfusion. Die Blase blockiert das Gefäß in der Leber und beeinträchtigt die Durchblutung.
