Diese Studie wurde mit Preisen der MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), der UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 und MR/K026666/1), des Chief Scientist Office (TCS/16/37) unterstützt.

1. Aufrechterhaltung der humanen pluripotenten Stammzelle (hPSC) auf Laminin-521
<ol><li>Halten Sie humane pluripotente Zellen (hPSCs) bei 37 °C und 5% CO2 in einer 6-Well-Platte auf Laminin-521 (LN-521). Füttern Sie die Zellen täglich mit 2 ml Stammzellerhaltungsmedium (d. H. mTeSR1-Medium) pro Vertiefung einer 6-Well-Platte bis zum gewählten Aussaattag zur Differenzierung (Tag 0).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die gewünschte Zellkonfluenz von 70-80% vor der Zellernte erreicht wird.</li>
</ol>2. Laminin-521 Multiwell-Präparation und hPSC-Aussaat zur Differenzierung
HINWEIS: Für hPSCs, die nicht auf LN-521 gehalten werden (z. B. Matrigel oder Fibronektin), teilen Sie hPSCs auf LN-521 auf und kulturieren Sie sie für 1 Woche, bevor Sie eine Differenzierung vornehmen und eine Differenzierung hervorrufen, um die Effizienz des Prozesses zu verbessern15,17,18.
<ol><li>Lamininbeschichtete Plattenzubereitung<ol>
<li>Auftauen Sie eine Durchstechflasche mit rekombinantem LN-521 (100 μg/ml) bei 4 °C für 2 h oder über Nacht.</li>
		<li>Eine 8 μg/ml Lösung wird durch Verdünnen des aufgetauten LN-521 in eiskaltem 1x DPBS mit Ca2+/Mg2+vorbereitet.</li>
		<li>0,25 ml der 8 μg/ml LN-521-Lösung werden zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte oder 0,05 ml zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzugefügt. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Vertiefungen gleichmäßig mit der LN-521-Lösung zu beschichten. HINWEIS: Für das 96-Well-Plattenformat können Volumendosierung, Zellaussaat und Mediumwechsel mit einer halbautomatischen Rohrleitung durchgeführt werden. Für Details siehe Meseguer-Ripolles et al.19.</li>
		<li>Versiegeln Sie die mit LN-521 beschichteten Platten mit einer halbtransparenten, flexiblen Folie und lagern Sie sie vor Gebrauch bei 4 °C über Nacht. HINWEIS: LN-521 beschichtete Platten können bei Lagerung bei 4 °C bis zu 2 Wochen verwendet werden. Vermeiden Sie jegliches Austrocknen der mit Laminin beschichteten Vertiefungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Am Tag der Zellaussaat die vorbeschichteten Platten in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 30–60 min aufwärmen.</li>
	<li>Saugen Sie die LN-521-Lösung an. HINWEIS: Vermeiden Sie den direkten Kontakt des Absaugers mit der Unterseite des Brunnens, um Schäden an der LN-521-Beschichtung zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie 0,5 ml Stammzellerhaltungsmedium mit frisch ergänztem 10 μM Rho-assoziiertem Kinase (ROCK)-Inhibitor Y27632 an jede Vertiefung einer 24-Well-Platte oder 0,05 ml an jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Platte in den Inkubator, bis sie für die Zellaussaat bereit ist.</li>
	<li>Markieren Sie am geplanten Aussaattag (Tag 0) und mit einer hPSC-Konfluenz zwischen 70-80% alle Regionen mit spontaner Differenzierung auf der Unterseite der Vertiefungen der 6-Brunnenplatte. HINWEIS: Spontane Differenzierung kann durch eine grobe Veränderung der Zellgröße und/oder das Vorhandensein verschiedener Zellmorphologien mittels Phasenkontrastmikroskopie visualisiert werden.</li>
	<li>Saugen und verwerfen Sie die markierten Differenzierungsbereiche und das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen. Waschen Sie jeden gut mit 1 ml DPBS ohne Ca2+/Mg2+ bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>1 ml enzymfreies Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle)in jede Vertiefung geben und bei 37 °C für 8–10 min inkubieren, bis sich die Zellen sichtbar von der Platte lösen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig von den Vertiefungen zu lösen. Pipetten Sie den Inhalt jeder Vertiefung 2-4x mit einer P1000-Pipette nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Für jede Zelllinie werden Poolzellen aus allen Wartungsbrunnen in ein steriles 50-ml-Röhrchen eingeschmiert.</li>
	<li>Waschen Sie jedes entleerte gut mit 1 ml des Stammzellerhaltungsmediums. Geben Sie die Waschungen in das entsprechende Röhrchen, das die gepoolten Zellen aus der entsprechenden Zelllinie enthält.</li>
	<li>Führen Sie für jede Zelllinie drei lebensfähige Zellzählungen für die gepoolten Proben durch. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl lebender Zellen (lebende Zellen/ml) für jede Zelllinie.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gepoolten Proben bei 250 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in 1–3 ml RT-Stammzellerhaltungsmedium, frisch ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632.</li>
	<li>Berechnen Sie für jede Zelllinie die Zellzahl, die für die Anzahl der in Schritt 2.4 vorbereiteten Vertiefungen benötigt wird (siehe Tabelle 1). Resuspendieren Sie die erforderliche Zellzahl mit Stammzellerhaltungsmedium, das frisch mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 ergänzt wurde.</li>
	<li>Fügen Sie die berechneten Volumen in die Vertiefungen der vorbereiteten und vorbeschichteten Platten aus Schritt 2.4 ein, ohne das zuvor hinzugefügte Volumen zu entfernen. Das Gesamtvolumen pro Bohrung beträgt 1 ml für eine 24-Well-Platte und 0,1 ml für eine 96-Well-Platte. Schaukeln Sie die Platten vorsichtig von seite zu Seite und hin und her, um eine gleichmäßige Zelldispersion im gesamten Bohrbrunnen zu gewährleisten. HINWEIS: Eine gleichmäßige Zellverteilung über den Brunnen ist der Schlüssel, um eine homogene Zellaussaat und eine erfolgreiche Differenzierung zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie die ausgesäten Platten in den Inkubator und schaukeln Sie die ausgesäten Platten sofort sanft hin und her und von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen und die Kulturen bei 37 °C und 5%CO2zu halten.</li>
</ol>3. Unterscheidung von hPSCs zu hepatischen Vorläufern auf Laminin-521
<ol><li>Bereiten Sie Medien für die definitive Endoderm-Induktion (Stufe 1) mit dem Endoderm Basal Medium vor, das mit den richtigen Additiven ergänzt wird.<ol>
<li>Am Tag 0 die Flasche des Endoderm Basal Medium über Nacht bei 4 °C auftauen.</li>
		<li>Bereiten Sie Stufe 1 Medium 1 (für die Anwendung an Tag 1) nach Bedarf vor.</li>
		<li>Tauen Ergänzung MR und Ergänzung CJ auf Eis.</li>
		<li>Verdünnen Sie Supplement MR und Supplement CJ 1:100 im Endoderm Basal Medium.</li>
		<li>Bereiten Sie Stufe 1 Medium 2 für die Verwendung an den Tagen 2 bis 4 nach Bedarf vor.</li>
		<li>Verdünnen Sie Supplement CJ 1:100 im Endoderm Basal Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Medien für die anschließende Differenzierung der hepatischen Vorläuferzellenspezifikation (Stadium 2) mit dem Hepatic Progenitor Medium vor.<ol>
<li>Am 4. Tag die Flasche des Hepatic Progenitor Medium über Nacht bei 4 °C auftauen. HINWEIS: Für dieses Experiment wurde 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen von 100 IE/ml bzw. 100 μg/ml) verwendet. Antibiotika sind nicht erforderlich; Die Verwendung von Antibiotika liegt im Ermessen des Benutzers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie an Tag 1 der Differenzierung das verbrauchte Stammzellerhaltungsmedium mit 10 μM ROCKi Y-27632 Medium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 0,5 ml komplettes Stadium 1 Medium 1 pro Vertiefung einer 24-Well-Platte und 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie an den Tagen 2, 3 und 4 das verbrauchte Medium und füttern Sie jede Vertiefung mit 0,5 ml Stufe 1 Medium 2 pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte oder 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fixieren Sie an Tag 5 die Vertiefungen für die definitive Endodermdifferenzierungsanalyse mittels Immunzytochemie. Für die verbleibenden Vertiefungen entfernen Sie das verbrauchte Medium und füttern Sie jede Vertiefung mit 0,5 ml Hepatic Progenitor Differentiation Medium pro Well für eine 24-Well-Platte oder 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte. Aktualisieren Sie das Medium an den Tagen 6, 7 und 9 erneut.</li>
	<li>Ernten Sie am 10. Tag Wells für die Hepatic Progenitor-Differenzierungsanalyse oder fahren Sie mit der weiteren hepatozytenähnlichen Zelldifferenzierung fort. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wurden die Proben entweder mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für die immunzytochemische Analyse fixiert oder Überstände für ELISA gesammelt und Zellen zur Proteinquantifizierung gesammelt.</li>
</ol>4. Charakterisierung der hepatischen Vorläuferdifferenzierungskulturen, die aus hPSCs auf Laminin-521 erzeugt wurden
<ol><li>Erkennen Sie an Tag 5 die Expression definitiver endodermspezifischer Marker mithilfe von Immunfärbung.</li>
	<li>Erkennen Sie am 10. Tag die Expression von hepatischen Vorläufer-spezifischen Markern mitHilfe von Immunfärbungen.</li>
	<li>Messen Sie an Tag 10 die AFP- und ALB-Sekretion über ELISA mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und normalisieren Sie pro mg Protein, wie durch einen Bicinchoninsäure (BCA) Proteinassay bestimmt.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Variabilität des hepatischen Vorläufers der 96-Well-Platte durch Quantifizierung des Prozentsatzes der HNF4α-positiven Zellen pro Vertiefung.</li>
</ol>5. Immunzytochemie und Bildaufnahme
<ol><li>An den Tagen 5 und 10 der Differenzierung waschen Sie die Zellen 3x mit 1x DPBS, mit 0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte und 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte mit sanftem Schütteln für 2-5 min bei RT. HINWEIS: Verwenden Sie DPSB ohne Ca2+/Mg2+ für die Immunzytochemie.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 15-30 min, indem Sie 0,3 ml PFA pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte und 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
	<li>Waschen Sie 3x mit 1x DPBS wie in Schritt 5.1 beschrieben.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Membran mit PBST unter Verwendung von 0,1% Tween, 1x DPBS und inkubieren Sie für 20 min bei RT, indem Sie 0,3 ml PBST pro Vertiefung einer 24-Well-Platte und 0,1 ml pro Well einer 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
	<li>Führen Sie den Proteinblock durch, indem Sie die Zellen mit 10% BSA in PBST für 1 h inkubieren, 0,3 ml BSA pro Vertiefung einer 24-Well-Platte und 0,1 ml BSA pro Well einer 96-Well-Platte hinzufügen und sanft mit einem Plattenshatterer schütteln.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach der Proteinblockierung die Blockierungslösung durch den primären Antikörper, der in 1% BSA in PBST verdünnt ist, und inkubieren Sie bei 4 °C mit sanftem Schütteln über Nacht. HINWEIS: Waschen Sie nicht zwischen Proteinblock und Antikörperzugabe.</li>
	<li>Nach 24 h Brunnen 3x mit PBST waschen.</li>
	<li>Fügen Sie den sekundären Antikörper in 1% BSA in PBST hinzu. 1 h bei RT im Dunkeln mit sanftem Schütteln inkubieren.</li>
	<li>Nach sekundärer Antikörperinkubation 3x mit 1x DPBS die Vertiefungen waschen und Hoechst Fleck gemäß Herstellerangaben für 10 min bei RT im Dunkeln mit sanftem Schütteln abgeben.</li>
	<li>3x mit 1x DPBS waschen. Die Platten sind nun bereit für die Bildgebung. HINWEIS: Lagern Sie die Platten bei 4 °C im Dunkeln bis zur Bildgebung.</li>
	<li>Stellen Sie die Multiwell-Platte mit einem hochauflösenden Bildgebungsmikroskop nach der Immunhistochemie ab. Die Bildaufnahme mehrerer Sichtfelder wird empfohlen, um eine echte Darstellung des Bohrbrunnens zu erhalten. Die Expression der verschiedenen Marker wurde mittels Zellsegmentierungsanalyse mit kommerzieller Software bewertet (siehe Materialtabelle)(Abbildung 1). HINWEIS: Die Zellsegmentierung kann auch mit einer Bildanalyse-Open-Source-Software wie CellProfiler oder Fiji20,21durchgeführt werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Szkolnicka, D., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Advances+in+Generating+Hepatocytes+from+Pluripotent+Stem+Cells+for+Translational+Medicine.">Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).</li><li>Heslop, J. A., Duncan, S. 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David C. Hay ist Mitbegründer und Aktionär von Stemnovate Ltd. Der Rest der Autoren bestätigt, dass sie keine Interessenkonflikte in dem in diesem Artikel behandelten Thema oder Material haben.

Die Generierung von humanen leberischen Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen in großem Maßstab könnte eine vielversprechende Alternative zu Kadavermaterial darstellen. Protokollstandardisierung und Reproduzierbarkeit sind der Schlüssel, um die Technologieübersetzung und -wirkung für die biomedizinische Forschung sicherzustellen. Um dies zu beheben, konzentrierten sich frühere Arbeiten auf die Entwicklung eines schrittweisen Differenzierungsprotokolls von hESC und iPSCs unter Verwendung definierter Additive und Matrizen15,23,24,25,26,27,28. Auf diese Weise wurden der Hepatozytenphänotyp und die Reproduzierbarkeit verbessert, was eine Halbautomatisierung des Differenzierungsprozesses ermöglicht19. Das vorgestellte System wird durch die Kombination mit handelsüblichen Zellkulturmedien und einem einfachen Hepatozyten-Differenzierungssystem verstärkt.
Zuvor wurde die pluripotente Zelldichte vor Beginn des Differenzierungsprotokolls als Schlüsselvariable hervorgehoben, um eine homogene Population von hepatischen Vorläuferzellen zu erreichen26. Mit diesem verfeinerten Verfahren ist es möglich, eine große Anzahl von stammzellbasierten leberlichen Vorläufern schrittweise unter Verwendung einer Reihe von Ausgangszelldichten zu erzeugen (Tabelle 1). An Tag 5 wurde die definitive Endoderminduktion durch Sox17-Färbung validiert (Abbildung 3). Eine effiziente und robuste Differenzierung in definitives Endoderm wurde sowohl mit getesteten ESC- als auch mit iPSC-Linien erreicht, wobei mehr als 80% Sox17 exprimiert wurden (Abbildung 3). An Tag 10 zeigten hepatische Vorläufer eine einheitliche kopfsteinsteinartige Morphologie, und Leberstammzellmarker waren sowohl für AFP als auch für HNF4α stark angereichert (>86%, Abbildung 4). Mit einer Kombination aus manuellen und halbautomatischen Technologien war es möglich, in mehreren Plattenformaten zu differenzieren19.
In ihrer jetzigen Form eignet sich die Zelldifferenzierung für In-vitro-basierte Experimente. Eine Zellanreicherung wäre jedoch wahrscheinlich vor der klinischen Anwendung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine homogene Population von Lebervorläufern für die Entbindung vorbereitet wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll dem Feld einen standardisierten Ansatz bietet, um hepatische Vorläufer in großem Maßstab herzustellen. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Herstellung eines neuen Mediums für die anschließende HLC-Differenzierung, -Reifung und -Wartung konzentrieren.

Lebererkrankungen stellen eine globale Gesundheitsherausforderung dar und verursachen weltweit etwa 2 Millionen Todesfälle pro Jahr1. Obwohl es eine Reihe von Modellsystemen gibt, um Lebererkrankungen zu untersuchen und klinisch einzugreifen, ist der routinemäßige Einsatz zellbasierter Systeme durch signifikante Nachteile begrenzt (für eine Überprüfung siehe Szkolnicka et al.2). Fortschrittliche Humanpluripotenten Stammzellkulturen (hPSC) und somatische Zelldifferenzierungsmethoden stellen vielversprechende Technologien dar, um Werkzeuge für die biomedizinische Grundlagenforschung und erneuerbare Quellen differenzierter Zellen für die Klinik zu entwickeln3,4.
Bis heute wurden mehrere Protokolle zur Hepatozyten-ähnlichen Zelldifferenzierung (HLC) entwickelt5,6,7,8. Diese Protokolle versuchen, Aspekte der menschlichen Leberentwicklung unter Verwendung einer Kombination von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren9,10nachzubilden. Die meisten Protokolle bestehen aus einem schrittweisen Differenzierungsprozess, bei dem hPSCs auf das definitive Endoderm vorbereitet werden, gefolgt von der hepatischen Vorläuferspezifikation11,12,13und endet mit der HLC-Spezifikation. HLCs, die von diesen Protokollen produziert werden, zeigen eine Mischung aus fetalen und erwachsenen Phänotypen. Dazu gehören die Expression von Alpha-Fetoprotein (AFP), wie Hepatozytenmarker wie HNF4α und Albumin (ALB), sowie die Metabolisierungskapazität des Arzneimittels14,15,16. Zwischen den Laboren kann die HLC-Differenzierung variieren; daher ist die Entwicklung standardisierter Protokolle notwendig. Dies wird es den Forschern ermöglichen, stammzellbasierte HLCs in großem Maßstab effektiv für die Grundlagen- und klinische Forschung zu generieren und anzuwenden.
Es wurde ein hepatisches Vorläufer-Differenzierungssystem entwickelt, das sowohl auf humane embryonale als auch auf induzierte pluripotente Stammzelllinien unter Verwendung leicht zu befolgender Richtlinien angewendet werden kann. Dieses Verfahren liefert homogene Populationen von Lebervorläufern in unterschiedlichen Kulturmaterialformaten, die von Zellkulturkolben bis zu 96 Wellplatten reichen. Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Herstellung von stammzellbasierten leberischen Vorläufern in 24- und 96-Well-Formaten.
Die im folgenden Protokoll verwendete Zelldichte ist für eine Vertiefung einer 24- bzw. 96-Well-Platte spezifiziert (siehe Tabelle 1). Für die verschiedenen Zellkulturplattenformate und Zelllinien ist eine Optimierung der Ausgangszellnummer erforderlich. Die empfohlene Ausgangszelldichte für die Protokolloptimierung beträgt 2 x 105 Zellen/cm2. Zur Dichteoptimierung können mehrere Zelldichten getestet werden, indem ± 50.000Zellen/cm2 gleichzeitig hinzugefügt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14040133</td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td>
			<td style="width:171px;">thermofisher</td>
			<td>R37165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:171px;">ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Endoderm Basal Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td>
			<td style="width:171px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Antibodies</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td style="width:107px;">1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td style="width:107px;">1:400 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">IgG</td>
			<td style="width:171px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sox17</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1:200 (Goat)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:323px;">Columbus Image Data Storage and Analysis system</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td style="width:107px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

Lebererkrankungen sind ein eskalierendes globales Gesundheitsproblem. Während die Lebertransplantation eine wirksame Therapieform ist, ist die Patientensterblichkeit aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von Spenderorganen gestiegen. Organknappheit wirkt sich auch auf die routinemäßige Versorgung mit menschlichen Hepatozyten für die Grundlagenforschung und die Klinik aus. Daher ist die Entwicklung erneuerbarer Quellen menschlicher Lebervorläuferzellen wünschenswert und das Ziel dieser Studie. Um menschliche Lebervorläufer in großem Maßstab effektiv erzeugen und einsetzen zu können, wurde ein reproduzierbares hepatisches Vorläuferdifferenzierungssystem entwickelt. Dieses Protokoll unterstützt die experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen Anwendern in einer Reihe von Zellkultur-Softwareformaten und ermöglicht Differenzierungen sowohl mit menschlichen embryonalen als auch mit induzierten pluripotenten Stammzelllinien. Dies sind wichtige Vorteile gegenüber aktuellen Differenzierungssystemen, die die Grundlagenforschung verbessern und den Weg zur klinischen Produktentwicklung ebnen können.

Die hepatische Vorläuferdifferenzierung von hESC (H9) und hiPSC (P106) Linien wurde nach dem in Abbildung 2beschriebenen schrittweisen Protokoll durchgeführt. Hier wurden pluripotente Stammzellen vor Beginn der Differenzierung als Einzelzellen in LN-521-beschichtete Platten eingesät. Zellkonfluenz ist der Schlüssel für eine robuste und reproduzierbare Differenzierung. Sobald die richtige Konfluenz erreicht war (Abbildung 2), wurde die Differenzierung eingeleitet. An Tag 5 wurde die definitive Endodermspezifikation anhand der Sox17-Expression beurteilt. In beiden Zelllinien war Sox17 mit 80% ± 0,5% bzw. 87,8% ± 0,5% REM von Sox17-positiven Zellen für H9 bzw. P106 hoch exprimiert(Abbildung 3). An Tag 10 zeigten hepatische Vorläufer eine kopfsteinpflasterartige Morphologie (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde die Hepatische Vorläuferspezifikation für HNF4α-, AFP-, ALB- und Cytokeratin-19 (CK19)-Expression sowie AFP- und ALB-Proteinsekretion10,15,22 ( Abbildung4) bewertet. Sowohl H9- als auch P106-Stammstoffkulturen exprimierten fetale Lebermarker wie HNF4α (91% ± 0,5% und 90% ± 0,2%), AFP (89,7% ± 1,8% und 86% ± 1,2%) und CK19 (78,5% ± 3,2% und 83,6 ± 1,8%)(Abbildung 4). AFP-Sekretion wurde an Tag 10 in beiden Zelllinien nachgewiesen (32,4 ± 1,6 und 47,8 ± 5,9 ng/ml/mg/24 h)(Abbildung 5). Die Albuminsynthese wurde bei niedrigeren Konzentrationen (30,7% ± 1,8% und 27,2% ± 1,1%) beobachtet (Abbildung 4) und nicht über ELISA nachgewiesen (Abbildung 5).
Das Protokoll ermöglichte die standardisierte Produktion von Lebervorläufern von 24 Well- bis 96 Wellplatten. Eine halbautomatische Pipeline wurde verwendet, um 96 Wellplatten von hepatischen Vorläuferzellen aus H9- und P106-Zelllinien herzustellen, wie zuvor beschrieben17. Die Variabilität der Zellzahl und die Differenzierungseffizienz des hepatischen Vorläufers wurden durch Quantifizierung der HNF4α-Expression bewertet. Die Zellsegmentierung wurde zur Proteinquantifizierung mittels Immunfluoreszenz mit einem bildgebenden Instrument mit hohem Gehalt durchgeführt (Abbildung 1). An Tag 10 zeigten hepatische Vorläufer keine signifikante Variabilität über Reihen hinweg mit >94% der HNF4α-positiven Zellen pro Vertiefung für H9 und 97% HNF4α-positiven Zellen für P106 (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die Zellsegmentierungspipeline. (A) Unter Verwendung des Originalbildes wurde (B) kernige Färbung für die Kernsegmentierung verwendet. (C) Es wurde ein Qualitätskontrollschritt der Kernsegmentierung auf der Grundlage von Form und Größe durchgeführt, um nur klar segmentierte Kerne zu quantifizieren. (D) Anschließend wurden positive HNF4α-gefärbte Kerne quantifiziert. (E) Schließlich wurde ein intensitätsbasierter Schwellenwert verwendet, um HNF4α-exprimierende Zellen zu identifizieren. In C und Estellen grüne Kerne ausgewählte Zellen dar und magentafarbene Kerne zeigen verworfene Zellen an. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Hepatische Vorläuferdifferenzierung von hPSCs. (A) Schematische Darstellung des hepatischen Vorläufer-Differenzierungsprotokolls. (B) Repräsentative Bilder, die die morphologischen Veränderungen während der Differenzierung hervorheben. An Tag 0 (D0) präsentierten hPSCs eine gepackte Monoschicht von Zellen. Anschließend wurden hPSCs am Tag 5 (D5) in das definitive Endoderm vorbereitet. Es folgte eine hepatische Vorläuferdifferenzierung am Tag 10 (D10). Hepatische Vorläufer zeigten eine kopfsteinsteinartigeZellmorphologie. Maßstabsleiste = 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Charakterisierung der definitiven Endodermspezifikation. An Tag 5 wurden Die Zellen für Sox17, einen definitiven Endodermmarker, gefärbt. Der Prozentsatz der Sox17-positiven Zellen betrug 80 ± 0,5% für H9 und 87,8 ± 0,5% für P106. Die prozentuale Quantifizierung basierte auf 10 separaten Bohrfeldern mit 6 Sichtfeldern pro Bohrung. Die Daten werden als durchschnittliche ± REM angezeigt. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> Abbildung 4: Charakterisierung des hepatischen Vorläufers. Am Tag 10 wurden hepatische Vorläufer für Lebermarker (A) HNF4α, (B) AFP und (C) ALB gefärbt. Für H9 betrug der Prozentsatz der positiven Zellen 91% ± 0,4%, 89,7% ± 1,8% und 30,7% ± 1,8% für HNF4α, AFP und ALB. Für P106 betrug der Prozentsatz der positiven Zellen 90% ± 0,2%, 86% +/- 1,2% und 27,2% ± 1,1% für HNF4α, AFP und ALB. (D) Das Cholangiozyten-Linienpotential wurde mittels CK19-Expression bewertet; H9-abgeleitete hepatische Vorläufer exprimierten 78,5% ± 3,2% CK19-positive Zellen, während 83,6% ± 1,8% der CK19-positiven Zellen für P106-Lebervorläufer beobachtet wurden. Immunglobulin G (IgG) Färbung wurde als Färbekontrolle verwendet. Die prozentuale Quantifizierung basierte auf 10 separaten Bohrfeldern mit 6 Sichtfeldern pro Bohrung. Die Daten werden als durchschnittliche ± REM angezeigt. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> Abbildung 5: Analyse der Hepatischen Vorläuferproteinsekretion. Die Sekretion von Alpha-Fetoprotein (AFP) und Albumin (ALB) wurde in hepatischen Vorläuferkulturen an Tag 10 in H9 und P109 analysiert. Die Daten repräsentieren drei biologische Replikate und die Fehlerbalken repräsentieren die SD. Sezernierte Proteine wurden aus 24 h Kulturmedium als Nanogramm sezerniertes Protein pro ml pro mg Protein quantifiziert, n = 3; ND = nicht erkannt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Bewertung der Well-to-Well-Variabilität in 96 Well-Platten. (A) Visualisierung einer 96-Well-Plattenansicht von H9-abgeleiteten leberartigen Vorläufern, die mit HNF4α gefärbt sind. (B) Quantifizierung der HNF4α-positiven Zellen. Durchschnitt der Zellzahl pro Vertiefung in Zeilen, aus sechs Sichtfeldern pro quantifiziertem Bohrfeld. Die durchschnittliche Zellzahl auf der Platte betrug 94,81% ± 0,22 SEM HNF4α-positiven Zellen pro Vertiefung. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Bohrungen beobachtet. (C) Visualisierung einer 96-Well-Plattenansicht von P106-abgeleiteten leberartigen Vorläufern, die mit HNF4α gefärbt sind. (D) Quantifizierung von HNF4α-positiven Zellen. Die durchschnittliche Zellzahl pro Vertiefung in Reihen, aus sechs Sichtfeldern pro Vertiefung und quantifiziert. Die durchschnittliche Zellzahl über die Platte betrug 97,7% ± 0,57 SEM HNF4α-positiven Zellen pro Vertiefung. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Zeilen beobachtet. Nun, H12 wurde als Immunglobulin G (IgG) Färbekontrolle verwendet. Maßstabsleiste = 1 mm. Es wurden Einweg-ANOVA mit Tukeys post-hoc-statistischen Tests verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Plattenformat</td>
			<td>Fläche (cm2)</td>
			<td>Zellen pro cm2</td>
			<td>Gesamtzellen pro Vertiefung</td>
			<td>Dosiervolumen (ml)</td>
			<td>Zellkonzentration (Zellen/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24-Well-Platte</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>96-Well-Platte</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Empfohlene Zelldichte für die verschiedenen Plattenformate für die in diesem Protokoll verwendeten hPSC-Zelllinien.

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Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K Aufrufe.  University of Edinburgh. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Serie: Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Charakterisierung von Oberflächenantigenen und Proliferationsfähigkeit in hiPSC-treibenden MSCs

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei iPSCs und der Erforschung genetischer Krankheiten 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...