Dieses Protokoll zeigt visuell, wie man ein langfristiges, zuverlässiges Kultursystem für das marine pelagische Tunika Oikopleura dioica etabliert. Das Oikopleura-Kultursystem stellt die Basisressourcen zur Verfügung, um eine breite Palette biologischer Bereiche in Bezug auf Ökologie, Entwicklung, Genomik und Evolution zu untersuchen. Diese Art hat einen kurzen Lebenszyklus, hohe Fruchtbarkeit, und es kann leicht von der Küste gesammelt werden, so dass es ein ausgezeichneter Modellorganismus.
Obwohl dieses Protokoll für O.dioica optimiert ist, hoffen wir, dass es auf andere planktonische Organismen angewendet werden kann. Um zu beginnen, initiieren Algennahrung, um Oikopleura Kultur zu erhalten, beginnend mit autoklavieren gefiltertem Meerwasser. Um eine Bestandskultur von Chaetoceros calcitrans zu initiieren, wurden 60 meilenlanges autoklaviertes Meerwasser mit folgenden:30 Mikroliter Vitaminen, 30 Mikroliter Lösung A, 15 Mikroliter Natriumsilikat und 60 Mikroliter Streptomycin ergänzt.
Schließlich wurden 30 Mikroliter C.calcitrans aus einer früheren Bestandskultur als Inoculant hinzugefügt. Siehe Tabelle 2 im Manuskript über Ergänzungs- und Impfvolumina für die anderen Algenarten und Kulturarten. Nach der Impfung werden der Bestand und die Subkulturen in einem Inkubator bei 17 Grad Celsius mit kontinuierlicher Beleuchtung gepflegt.
Nach ca. 10 Tagen wird das Algenwachstum durch die Farbgefärbten der Kolben bestätigt. Wenn dies geschieht, verschieben Sie die Bestandskulturen bis zu einem Monat lang bei vier Grad Celsius in die Langzeitlagerung, während die Subkultur im selben Brutkasten erhalten bleibt. Um eine Arbeitskultur zu schaffen, fügen Sie notwendige Ergänzungen zu 400 mils autoklaviertes Meerwasser hinzu und impfen Sie mit 100 mils der vorherigen Subkultur.
Versiegeln Sie den Kolben mit einer Gummikappe, legen Sie eine Einwegpipette ein, und bewegen Sie sie zu einer Algenstation und halten Sie sie bei Raumtemperatur mit einer achtstündigen Fotoperiode und konstanter Belüftung. Zweimal täglich algenllassende Kulturen manuell wirbeln, um eine Aggregation am Boden des Kolbens zu verhindern. Sobald die Algenkulturen etabliert sind, sammeln Sie Feldproben an einem lokalen Standort.
Gießen Sie ein Planktonnetz, und lassen Sie das Kabeljau Ende ein bis zwei Meter unter der Oberfläche sinken. Schleppen Sie das Netz mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 1 Meter pro Sekunde. Fahren Sie zwischen zwei und fünf Minuten hin und her.
Die Abschleppzeit sollte entsprechend dem Planktonreichtum vor Ort angepasst werden. Nach dem Abschleppen vorsichtig das Netz herausheben und den Inhalt des Kabeljaus langsam in eine 500-Meilen-Glasflasche übertragen. Füllen Sie die Flasche bis zum Rand, um Luftblasen zu vermeiden, die stressen für die Tiere während des Transports verursachen könnten.
In diesem Stadium kann das Vorhandensein von Oikopleura durch die Betrachtung der Probenflaschen vor einem dunklen Hintergrund bestätigt werden. Für die Identifizierung auf Artenebene ist jedoch eine mikroskopische Beobachtung erforderlich. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis drei 500-Meilen-Flaschen gesammelt wurden.
Sammeln Sie Oberflächenmeerwasser, um Salzgehalt, Temperatur und Chlorophyllkonzentration mit einem CTD-Profiler aufzuzeichnen. Sammeln Sie zusätzlich 10 bis 15 Liter Meerwasser vor Ort, um die Tiere an Laborbedingungen zu gewöhnen. Um die Tiere zu akklimatisieren, bereiten Sie ein 1:1-Verhältnis von Oberflächen-Meerwasser aus dem Probengelände und gefiltertem Meerwasser vor, das im Labor gehalten wird.
Das Endvolumen sollte je nach Konzentration der Planktonprobe auf fünf bis zehn Liter eingestellt werden. Die 500-Mil-Probe vorsichtig in den vorbereiteten Becher geben. Mit einem Paddel, das an einem Synchronmotor befestigt ist, der sich bei 15 Umdrehungen pro Minute dreht, halten Sie das Plankton über Nacht in Dersuspension.
Überprüfen Sie am nächsten Morgen die Anwesenheit von Oikopleura mit dem Auge. Übertragen Sie die Tiere auf eine Petrischale und beobachten Sie unter einem Dunkelfeldmikroskop, das 20 bis 40 Mal zwischen der Vergrößerung eingestellt ist, um eine positive Identifizierung zu erhalten. Oikopleura sind als kaulenförmige Tiere gekennzeichnet, die ihre Schwänze in einem durchscheinenden Haus wellig ieren.
Um O.dioica zu bestätigen, suchen Sie nach vollreifen Männchen mit gelben Gonaden oder Weibchen mit Eiern. Wenn die Tiere unreif sind, achten Sie auf das Vorhandensein von zwei subchordalen Zellen an der distalen Hälfte des Schwanzes. Diese sind sowohl bei reifen als auch bei unreifen Tieren vorhanden.
Sobald die Art bestätigt ist, übertragen Sie sie auf eine neue Petrischale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis 10 bis 20 Individuen auf Artenebene bestätigt wurden. Wenn keine O.dioica gefunden werden, halten Sie den Becher für ein oder zwei Tage rühren.
Kleine O.dioica, die anfangs nicht beobachtbar waren, werden weiter wachsen und leichter zu sehen sein. Wenn nach einer Woche keine sampeln, verwerfen Sie die Probe, und versuchen Sie erneut, die Probezuführen durchzuführen. Um eine Monokultur zu etablieren, isolieren Sie 120 O.dioica aus einer Feldprobe in fünf Litergefiltertem Meerwasser.
Achten Sie am nächsten Morgen auf vollreife Männchen, die von gelben Gonaden identifiziert werden, und nach Weibchen mit Eiern, die als schimmernde, goldene Kugeln erscheinen. Bereiten Sie einen Laichbecher vor, indem Sie 15 Männchen und 30 Weibchen mit einer fünf-Mil- und stumpfen Pipette sanft in einen Becher mit 2,5 Litergefiltertem Meerwasser übertragen. Um körperliche Belastungen während des manuellen Transfers zu minimieren, lassen Sie die Tiere langsam unter der Oberfläche des neuen Meerwassers frei.
Lassen Sie isolierte Erwachsene auf natürliche Weise laichen. Nach dem Laichen kann eine erfolgreiche Befruchtung bestätigt werden, indem fünf bis 10 Meilen Meerwasser vom Grund des Laichbechers extrahiert und Eier mit Spaltungen unter dem Mikroskop identifiziert werden. Am ersten Morgen nach dem Laichen, dem ersten Tag, sollte eine neue Generation von Jungtieren mit aufgeblasenen Häusern im Becher erscheinen.
Verwenden Sie einen 500-Meilen-Handbecher, um Tiere sanft in ein neues Becherglas mit 7,5 Liter frischem, gefiltertem Meerwasser zu bringen. Gießen Sie den Inhalt langsam an die Oberfläche, um Turbulenzen und Scherkräfte zu minimieren. Am zweiten Morgen nach dem Laichen, Tag zwei, bringen Sie 150 Tiere manuell in ein neues Becherglas mit fünf Literfrischem, gefiltertem Meerwasser.
Am dritten Morgen nach dem Laichen, Tag drei, überführen Sie 120 Tiere manuell in ein neues Becherglas mit fünf Litern frischem, gefiltertem Meerwasser. Bis zum vierten Tag sollten geschlechtsreife, erwachsene Tiere anwesend sein. Sammeln Sie 15 Männchen und 30 Weibchen für einen neuen Laichbecher mit 2,5 Litergefiltertem Meerwasser, um die nächste Generation zu initiieren.
Dieser Prozess wird wiederholt und für das Leben der Kultur aufrechterhalten. Um eine Monokultur von O.dioica aufrechtzuerhalten, werden Algennahrung täglich aus Arbeitskulturen zubereitet. Die Tiere werden dreimal täglich gefüttert.
Bereiten Sie die tägliche Nahrung vor, indem Sie die Absorption der Arbeitskultur mit einem Spektralphotometer auf 660 Nanometer messen. Absorptionswerte, Ziel-O.dioica-Kulturvolumen und tierische Reife werden in eine vorbereitete Tabelle eingefügt, die auf einer zuvor ermittelten Algenwachstumskurve basiert, um das genaue Algenvolumen zu berechnen, das für die Fütterung des Tages erforderlich ist. Die berechneten Volumina in 50-Meilen-Rohre und Zentrifuge bei 5 000g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zerführen.
Langsam überstand gießen und sorgfältig Pipette auf und ab gießen, um die pelletierten Algen wieder aufzuhängen. Füllen Sie die Rohre auf ihr ursprüngliches Volumen mit frischem, gefiltertem Meerwasser. Basierend auf dem täglichen Algenfütterungsdiagramm aus der Tabelle, füttern Sie die angegebene Menge zu jedem Becher bei 9 a.m.
12 .m und 17.m. Eine automatische Dosierpumpe kann eingestellt werden, um die Tiere mit 5 p.m zu füttern.
an Wochenenden ohne das Vorhandensein von Kultivierungspersonal. Nach jeder Fütterung die zubereitete Algennahrung bei vier Grad Celsius aufbewahren, bis sie für das nächste Futter verwendet werden kann. O.dioica kann aus einem Hafen durch das sanfte Abschleppen eines modifizierten Planktonnetzes mit 100-Mikron-Netz und einem nicht filternden Kabeljau-Ende gesammelt werden.
Die Probenahme zwischen 2015 und 19 zeigte saisonale Schwankungen in Anwesenheit von O.dioica in den Häfen von Okinawa. Die Oberflächentemperatur des Meerwassers schien die Anwesenheit der Tiere zu beeinflussen. O.dioica dominierte, wenn die Oberflächentemperatur des Meerwassers 28 Grad oder höher war.
O.dioica koexistierte mit Oikopleura longicauda bei Temperaturen zwischen 24 und 27 Grad. Allerdings dominierte O.longicauda bei Temperaturen unter 23 Grad. Veränderungen des Salzgehalts korrelierten nicht mit der Fülle von O.dioica.
Die drei wichtigsten Faktoren für die Etablierung stabiler O.dioica-Kultursysteme sind die Aufrechterhaltung einer hohen Wasserqualität mit einem mehrstufigen Filtersystem, die Identifizierung eines optimalen Fütterungssystems, vorzugsweise durch die Erstellung von Algenstandardkurven, und die Vorbereitung von Laichbechern mit einer ausreichenden Anzahl von Männchen und Weibchen. Nach dem bereitgestellten Protokoll beträgt der Lebenszyklus von O.dioica vier Tage bei 23 Grad. Wir haben zuverlässig sechs unabhängige Populationen von O.dioica etabliert, die alle mehr als 20 Generationen dauerten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung einer stabilen Kultur von O.dioica schnell und kostengünstig erfolgen kann. Mit einem richtigen Setup kann innerhalb einer Woche eine stabile Kultur erreicht werden. In Verbindung mit seinem kleinen Genom und seinem schnellen Lebenszyklus macht dies O.dioica zu einer leistungsstarken Chordatenmodellart.
O.dioica kann sowohl in künstlichem als auch in natürlichem Meerwasser gehalten werden. Langfristige Lagerung von Algennahrung ist mit fester Kultur und Kryokonservierung möglich. Darüber hinaus kann O.dioica Sperma auch kryokonserviert werden und lebensfähig für mehr als ein Jahr bleiben.
O.dioica bietet weiterhin kraftvolle Einblicke in verschiedene biologische Felder. Ein Verständnis der lokalen Saisonalität, ein akribisches Kultursystem und ein paar engagierte Individuen ermöglichen es, mit wenig Aufwand eine effektive Kultur zu etablieren.
