Seetangwälder sind aufgrund klimabedingter Umweltstressoren und Verschiebungen in der trophischen Dynamik mit beispiellosen Verlusten konfrontiert. Dieses Video veranschaulicht ein Protokoll und Werkzeuge für die Kultivierung von Riesentang, Macrocystis pyrifera, unter Verwendung der Grünkiestechnik und bietet eine wertvolle Ressource für weitere Versuche, um die Erfolge und Grenzen dieser Methode in verschiedenen Umgebungen zu untersuchen. Kelp-Zuchtanlagen müssen in der Lage sein, Temperaturen zwischen 10 und 15 Grad Celsius zu kontrollieren, Vollspektrumlicht zwischen null und 180 Mikromol-Photonen pro Quadratmeter pro Quadratsekunde und gefilterte Belüftung bereitzustellen.
Inkubatorsysteme mit eingebautem Auslass oder einer Zugangsöffnung für Drähte und Schläuche können mit Leuchten und einer Luftquelle angepasst werden. Wenn ein Inkubatorsystem nicht innerhalb des Umfangs, des Budgets oder des beabsichtigten Umfangs des Projekts liegt, können Wasserbäder verwendet werden, die entweder mit kühlem natürlichem Meerwasser temperiert werden, oder ein Kühler. Die Aufzuchttemperaturen sind standort- und jahreszeitabhängig.
Stellen Sie ein Thermometer in Wachstumsmedien oder verwenden Sie eine Temperaturpistole, um sicherzustellen, dass die Temperatur zwischen 10 und 18 Grad Celsius liegt. Stellen Sie Vollspektrumlichter auf eine 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelfotoperiode ein, indem Sie die Timing-Einstellungen an der Lichtquelle verwenden oder die Lichtquelle an einen Timer mit programmierbarem Zyklus anschließen. Messen Sie die Lichtintensität mit einem PAR-Quantenmessgerät unter der Oberfläche in der Nähe des Kieses und stellen Sie sie mit einer dimmbaren Lichtquelle oder durch Schichten eines Netzes über der Lichtquelle ein.
Die Belüftung wird den Kulturen mit Hilfe von Luftpumpen zugesetzt. Verwenden Sie Filter mit einer Porengröße von 02 Mikrometern, um die bakterielle Kontamination in der Luft zu reduzieren. Materialien und Stationen sollten im Voraus sterilisiert und vorbereitet werden.
Siehe Text für Details. Kies, der für die Aussaat verwendet wird, sollte eine strukturierte oder leicht entkernte Oberfläche haben, da Gametophyten eher auf Substraten mit hoher Rauheit zurückgehalten werden. Schrubben und spülen Sie Kies, bis das Wasser klar ist, um Staub oder Schmutz zu entfernen.
Kies mindestens 24 Stunden in einer 10% verdünnten Bleichlösung einweichen und mit filtersterilisiertem Meerwasser abspülen. Berechnen Sie die Menge an filtersterilisiertem Meerwasser, die jede Woche zur Auffrischung von Kulturbehältern benötigt wird, und planen Sie diese Filtrations- und Sterilisationsaufgabe entsprechend. Große Mengen filtersterilisiertem Meerwasser können in dunklen Behältern bis zu sechs Monate bei acht bis 10 Grad Celsius gelagert werden.
Wenn keine Kühlung verfügbar ist, lagern Sie es an einem dunklen, kühlen Ort. Filtern Sie Wasser mit einem Vakuumfiltrationssystem mit einer Porengröße von 55 bis zu einem Mikrometer. Schalten Sie die Vakuumquelle aus, bevor das gesamte Wasser durchgezogen ist, um eine Beschädigung des Filters zu vermeiden, und gießen Sie das gefilterte Wasser in einen speziellen sterilen Behälter.
Bei größeren Volumina kann ein Durchflussfiltrationssystem verwendet werden. Lassen Sie beispielsweise Meerwasser durch eine Reihe von drei Faltenfiltern, 10 Mikrometer, fünf Mikrometer und einen Mikrometer, angeordnet von der größten bis zur kleinsten Porengröße. Dieses Durchflusssystem ist mit einem UV-Licht im Aquarium verbunden.
Sterilisieren Sie gefiltertes Meerwasser mit UV- und/oder Autoklaviermethoden. Die Anreicherung von filtersterilisiertem Meerwasser mit Nährstoffen und Vitaminen ist entscheidend für das Wachstum von Seetang. Zu den gängigen Anreicherungsoptionen gehören mit Provasoli angereicherte Meerwassermedien und F/2-Medien.
Siehe Text für Details. Holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für die Entnahme von Seetanggewebe ein, die den örtlichen Gesetzen und Vorschriften entsprechen. Wählen Sie beim Tauchen drei bis fünf Sporophyllklingen von 10 bis 15 fruchtbaren Macrocystis pyrifera-Individuen mit sichtbaren Sori im Abstand von zwei bis fünf Metern aus.
Wählen Sie nach Möglichkeit saubere und intakte Sporophylle mit wenig bis gar keiner Verschmutzung oder Degradation. Lagern Sie Sporophyllklingen ab diesem Zeitpunkt getrennt nach dem Elternindividuum. Sporophylle wachsen in einem dichten Mantel an der Basis über dem Halt des erwachsenen Seetangs und sind an ihrem Fehlen gasgefüllter Pneumatozysten zu erkennen.
Transportieren Sie Sporophyllklingen in dunklen Auffangbeuteln, um eine übermäßige Sonneneinstrahlung zu vermeiden, die nur minimal mit Meerwasser vom Standort gefüllt ist, um die Klingen feucht zu halten, und lagern Sie sie in Kühlboxen bei ca. 12 Grad Celsius bis zur Ankunft im Zuchtraum. Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht in direktem Kontakt mit Eis stehen. Sporophylle können an oder von anderen Orten aus versendet werden.
Sporophylle mit gefiltertem, sterilisiertem Meerwasser abspülen. Wickeln Sie die von einem einzelnen Macrocystis pyrifera-Individuum gesammelten Klingen in feuchte Papiertücher, die in gefiltertem, sterilisiertem Meerwasser getränkt sind, und erneut in Aluminiumfolie, um das Eindringen von Licht und zusätzliche Austrocknung zu vermeiden. Diese Art der Lagerung ist allgemein als Burrito-Methode bekannt.
Legen Sie diese Verpackungen in eine Kühlbox mit Eis mit einer Schutzbarriere, z. B. recycelter Luftpolsterfolie oder Pappe. Bereiten Sie die Kühlbox für den Versand über Nacht vor und stellen Sie sicher, dass jemand verfügbar ist, um die Sendung entgegenzunehmen und die Pakete gekühlt aufzubewahren. Lagern Sie Sporophylle optional 12 bis 48 Stunden lang unter gekühlten Bedingungen, was die Sporenfreisetzung aus Sorusgewebe fördert.
Verwenden Sie zum Aufbewahren die Burrito-Methode. Bei optionaler Lagerung finden Sie auf den Papiertüchern Anzeichen einer teilweisen Sporulation, die auf das Vorhandensein von fruchtbarem Sorusgewebe hinweisen. Sorusgewebe ist oft leicht erhaben und dunkler gefärbt als das umgebende Gewebe.
Wählen Sie reifes Sorusgewebe aus und schneiden Sie es mit einer sterilen Schere in 25 Zentimeter große quadratische Abschnitte. Wählen Sie ein bis zwei saubere Sori-Abschnitte von 10 bis 15 einzelnen Seetangeltern aus, um die genetische Vielfalt zu fördern. Schrubben Sie zum Reinigen beide Seiten des Sorusgewebes vorsichtig nur in eine Richtung mit einer sterilen Gaze, die mit filtersterilisiertem Meerwasser angefeuchtet ist.
Kratzen Sie das Sorusgewebe bei Bedarf vorsichtig mit einer sterilen Rasierklinge ab. Tauchen Sie den Sori-Abschnitt 30 Sekunden bis eine Minute lang in ein Süßwasserbad und spülen Sie ihn mit filtersterilisiertem Meerwasser ab. Tauchen Sie jeden Sori-Abschnitt in filtersterilisiertes Meerwasser, das in einem sterilen 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen auf 10 bis 15 Grad Celsius temperiert ist.
Alternativ können Sori-Abschnitte in einem einzigen sterilen Behälter sporulieren. Legen Sie die Röhrchen bei vier bis 12 Grad Celsius in die Dunkelheit, um maximal vier Stunden lang zu sporulieren. Wenn kein Kühlschrank verfügbar ist, lagern Sie es an einem kühlen, lichtschwachen Ort.
Beobachten Sie mit einem Verbundmikroskop und einem Hämozytometer die Sporendichte von drei bis vier Proben alle 30 Minuten bis zu vier Stunden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Proben. Wenn die Dichte mindestens 10.000 Sporen pro Milliliter beträgt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
Wenn ein Sori-Schnitt nach vier Stunden keine Sporen produziert, ist die Probe zu verwerfen. Sporen können sich innerhalb von Stunden nach der Freisetzung ansiedeln, können aber auch beim Schwimmen in kreisenden Bewegungen beobachtet werden. Entferne jeden der Sori-Abschnitte aus ihren Falcon-Röhren.
Kombinieren Sie die resultierenden Sporenlösungen in einem einzigen sterilisierten Behälter und quantifizieren Sie die endgültige kombinierte Dichte. Berechnen Sie das endgültige Volumen der Sporenlösung, das für die Inokulation benötigt wird, für eine Endkonzentration von 500 bis 1.000 Sporen pro Milliliter in Kulturbehältern. Siehe Text für Details.
Legen Sie sterile Glasobjektträger in Kulturbehälter, um die Seetangentwicklung zu überwachen. Fügen Sie mindestens 30 Objektträger hinzu, die nach dem Zufallsprinzip auf Kulturbehälter verteilt sind, um eine ausreichende Überwachung zu gewährleisten. Das berechnete Volumen der Sporenlösung wird mit einer sterilen Pipettenspitze, die in Wachstumsmedien getauchte Substrate enthält, in den Kulturbehälter inokuliert.
Schließen Sie den Behälter und rühren Sie vorsichtig um, um die Sporen zu verteilen. Stellen Sie den Behälter in Ihr Kultursystem. Stellen Sie Ihre Temperatur zwischen 10 und 15 Grad Celsius ein, basierend auf der Temperatur an Ihrem Einsatzort.
Vollspektrumlampen für Wasserpflanzen sind auf einen 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus mit Lichtintensitäten zwischen null und 180 Mikromol-Photonen pro Quadratmeter pro Quadratsekunde eingestellt. Siehe Text für eine Zeitleiste mit bestimmten Lichtverhältnissen. Nach einem Tag mit einer gefilterten Luftquelle für eine leichte Belüftung sorgen.
Überwachen Sie in den ersten zwei Wochen mindestens zwei zufällige Objektträger täglich oder jeden zweiten Tag, um die Entwicklung zu beurteilen. Überwachen Sie nach zwei Wochen mindestens zwei zufällige Objektträger ein- bis zweimal wöchentlich auf gesundes Wachstum und Kontamination, bis die Sporophyten ein bis zwei Zentimeter groß werden. Zur Überwachung den Objektträger mit einer sterilisierten Pinzette anfassen und in eine saubere Petrischale legen, die genügend sterilisiertes Meerwasser enthält, um den Objektträger einzutauchen.
Geben Sie Glasobjektträger nach dem Entfernen nicht in Kulturen zurück, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie ein zusammengesetztes oder inverses Mikroskop mit einer 40- bis 400-fachen Vergrößerung, um Seetang im Frühstadium zu beobachten. Die Entwicklung wird voraussichtlich dem folgenden Zeitplan folgen.
Angesiedelte Sporen werden bei null bis einem Tag beobachtet. Sporen können innerhalb weniger Stunden keimen, was sich in der Bildung eines Keimschlauchs zeigt. Die Keimung wird typischerweise nach ein bis zwei Tagen beobachtet.
Frühe Gametophyten werden typischerweise nach ein bis vier Tagen beobachtet. Gametogenese, der Prozess, bei dem sich Zellen teilen und differenzieren, um männliche und weibliche Gameten zu bilden, wird typischerweise innerhalb der ersten zwei Wochen beobachtet. Weibliche Zellen sind fünf- bis siebenmal größer als männliche.
Männliche Gametophyten wachsen dünne fadenförmige Äste, während Weibchen runder oder eiförmiger sind. Weibchen produzieren in der Regel innerhalb von zwei bis drei Wochen Eier. Die von den Männchen freigesetzten Spermien befruchten die Eier, die sich zu embryonalen Sporophyten entwickeln.
Sporophyten werden typischerweise innerhalb von zwei bis vier Wochen beobachtet. Die Zygote durchläuft eine schnelle Zellteilung, was innerhalb von etwa sechs bis acht Wochen zum Wachstum von ein bis zwei Zentimetern großen Klingen führt. Wechseln Sie jede Woche das Wachstumsmedium, um die notwendigen Nährstoffe und Mineralien für das Wachstum von Macrocystis pyrifera wieder aufzufüllen.
Kühlen Sie frische Wachstumsmedien auf die entsprechende Temperatur. Achten Sie darauf, dass das Nährmedium während dieses Prozesses 15 Grad Celsius nicht überschreitet. Saugen Sie Medien aus Ihren Kulturbehältern, um die Störung der ausgesäten Substrate zu vermeiden.
Lassen Sie das Medium abtropfen, bis der Behälter fast leer ist. Aktualisieren Sie die Medien sofort, um das Austrocknen zu minimieren. Kippen Sie die Wachstumsbehälter beim Nachfüllen leicht, damit das Medium an der Seite des Kulturbehälters herunterläuft, um die Substrate so wenig wie möglich zu stören.
Ordnen Sie die Positionen von Behältern oder Wannen während des wöchentlichen Medienwechsels nach dem Zufallsprinzip an, um Unterschiede in der Lichteinstrahlung zu berücksichtigen. Siehe den Text für einen Kalender, um Aktivitäten und Erwartungen für Macrocystis-Kulturen zu verfolgen. Es zeigt den Zeitpunkt der Anpassung von Licht und Belüftung sowie den wöchentlichen Medienwechsel an.
Nach sechs bis acht Wochen Laborkultivierung sind die jungen Sporophyten ein bis zwei Zentimeter lang und bereit für den Einsatz. Aktualisieren Sie Wachstumsmedien in Kulturbehältern 24 Stunden vor der Bereitstellung. Holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für den Kieseinsatz ein, die den örtlichen Gesetzen und Vorschriften entsprechen.
Transportieren Sie grünen Kies bis zu sechs Stunden in einer schattigen Kühlbox. Der Einsatz sollte zeitlich so gewählt werden, dass die direkteste Sonneneinstrahlung vermieden wird. Verwenden Sie eine schattige Struktur auf dem Boot, um direkte Sonneneinstrahlung während des Einsatzes zu vermeiden.
Streuen Sie vorsichtig grünen Kies von der Oberfläche auf das darunter liegende Riff oder durch Tauchen, wenn Sie an neuen Standorten und in kleinem Maßstab testen. Die Technik der Wiederherstellung von Grünkies befindet sich noch in der akademischen Phase, mit begrenzten Daten zum Überleben von Außenpflanzen für andere Arten und noch keine Daten für Macrocystis pyrifera. Nichtsdestotrotz wurde in einer kürzlich durchgeführten Pilotstudie ein Erfolg im Feld beobachtet, der durch die Anhaftung von Haptera an das umgebende Substrat und juvenilen Seetang angezeigt wurde, der nach zwei Monaten im Feld bis zu 1,2 Meter hoch wurde.
Unter Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Feldsammlung und Laborwartung kultivierten wir zwei verschiedene Donor-Kelp-Populationen bei 12 Grad Celsius und 20 Grad Celsius, um temperaturabhängige Auswirkungen auf die Entwicklung von Mikrostadien von Macrocystis pyrifera im Laufe der Zeit aufzuklären. Nach 24 Tagen wurden Gametophyten anhand von Mikroskopbildern gezählt. Die Temperatur hatte einen Effekt für die kühlere K1-Population, aber nicht für die K4-Population, was auf eine mögliche adaptive Divergenz in den thermischen Toleranzmerkmalen hindeutet.
Dies unterstreicht die Bedeutung standortspezifischer Aufzuchttemperaturen. Nach 32 Tagen wurden sichtbare Sporophyten auf jedem Objektträger gezählt. Die Temperatur hatte einen ähnlichen Effekt sowohl für die K1- als auch für die K4-Population.
Proben, die bei 20 Grad Celsius aufgezogen wurden, wuchsen nur wenige sichtbare Sporophyten im Vergleich zu denen, die bei 12 Grad Celsius aufgezogen wurden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Sporophytenproduktion temperaturempfindlicher ist als das Gametophytenstadium und dass die Kultivierungstemperaturen 15 Grad Celsius nicht überschreiten dürfen, um die Sporophytenentwicklung zu erreichen, wie im Protokoll beschrieben. Mit diesem visualisierten Protokoll hoffen wir, weitere Versuche mit der Grünkiesmethode zu fördern, um die Wiederherstellung wertvoller Unterwasser-Seetangwälder durch Forscher und Manager weltweit zu verbessern.
Viel Glück auf Ihrer grünen Kiesreise mit Macrocystis pyrifera.
