Die Autoren bedanken sich Mattias Gyllborg für Kalmare von Einrichtungen zur Förderung und für Kommentare zu diesem Manuskript, Michael Hadfield und die Kewalo Marine Laboratory für die Unterstützung während der Bereich Sammlung, und Mitgliedern der Ruby und McFall-Ngai Labor für Beiträge zu diesem Protokoll. Arbeit in der Mandel-Labor ist von der NSF IOS-0843633 gefördert.

1. Zubereitung von bakteriellen Inokula <ol><li> Tag 0 Zwei Tage vor der Impfung Tintenfisch, Teller die relevanten Bakterienstämme auf 13 LBS-Agar. </li><li> Inkubieren Bakterien bei 25-28 ° C über Nacht. </li><li> Tag 1 Beimpfen 3 ml LBS-Medium in einem Glas Kultur Rohr mit einer Kolonie von jedem V. fischeri Belastung für eine Infektion. Bereiten Sie doppelte Röhren als Backup. </li><li> Tag 2 (Koordinieren bakteriellen 1,4-1,6 Schritten mit Tintenfisch Schritten von 3,7 bis 3,10) 1 h vor der Inokulation, Subkultur Bakterien 1:80 (37,5 ul) in 3 ml LBS in einem gläsernen Röhre und Kultur wachsen für 1 h mit Belüftung. </li><li> Messen der OD 600 von der Probe vor der Inokulation. Typische Messungen sind 0,3 bis 0,6 je nach Stamm. </li><li> Für ein Ziel Inokulum von 3-5 x 10 3 CFU / ml Inoculum berechnen Volumen wie folgt: Inokulum Volumen (ul) = 1,25 / OD 600 (z. B. für OD 600 = 0,5, die berechnete Inokulum volume = 1.25/0.5 = 2,5 ul). Dieser Betrag ist direkt mit dem Meerwasser mit Tintenfisch in Schritt 4.1 hinzugefügt. Diese Berechnung kann es für verschiedene Stämme von V. eingestellt werden fischeri oder für die Impfung bei niedrigeren oder höheren Niveaus als die hier angegebenen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Agarplatten für Enumeration der Inokula <ol><li> Bei jeder Behandlung Label LBS (2 pro Behandlung), um Platten-Proben des Inokulums in Schritt 4.1. </li><li> Geben Sie 5 sterilen Plating Perlen pro Platte. </li></ol> 3. Sammlung von Squid Jugendliche <ol><li> Messen Sie den Salzgehalt von Instant Ocean mit dem Refraktometer und passen auf 35 ‰. </li><li> Filter 1 l Instant Ocean mit der Filteranlage und eine angehängte Vakuumleitung oder Vakuumpumpe, um Filter-sterilisierte Instant Ocean (BSV) zu generieren. Oxydieren das Wasser durch Verwirbelung kräftig vor jeder Abgabe. The Filtereinheit für 2 Tage wieder verwendet werden. </li><li> Aliquotieren 40-50 ml BSV in jede von zwei (2) Einweg Probeschälchen. Beschriften Sie ein als Earlies und eine als timelies. </li><li> Bereiten Sie einen Überschuss von Kunststoff Transferpipetten für den Erwerb der juvenilen Tintenfisch durch Zerschneiden des Pipette ca. 1 cm von der Spitze, über den niedrigsten Erhebungen (siehe Abbildung 3). Dies ermöglicht eine größere Fläche, durch die der Tintenfisch bei Abholung übergeben werden können. Verwerfen Sie Transferpipetten, in dem es eine grobe freiliegenden Oberfläche. </li><li> Mit vorbereiteten Transferpipetten, sammeln E. scolopes, dass über Nacht geschlüpft und Transfer zum Earlies Schüssel BSV. Frühe Jungtiere in das Ei für über 1 h waren und sind anfällig für die Ansiedlung von kontaminierenden V. fischeri in dem Ei-System. Verwenden Sie keine Earlies für empfindliche Experimente Kolonisation. </li><li> Überprüfen Sie jedes Ei Tanks 30-45 min für neue Jungtiere. Sicherstellen, dass alle Jungtiere während jedes c werden gelöschtHeck. Entfernen Sie Schlüpflinge mit einer Transferpipette und Einzahlung in die Schüssel mit timelies BSV. Tiere in einer zeitgemäßen Weise gesammelt werden, sind verfügbar für die Kolonisation Experimente. </li><li> Wenn die Sammlung abgeschlossen hat (~ 45 min nach Einbruch der Dunkelheit), überweisen Sie den Tintenfisch an den Haupt-Labor. Empirisch ist es vorteilhaft, die Tiere unter ununterbrochener Labor Lichtverhältnissen für 3 h Impfungen zu kolonisieren. </li><li> Für jede Behandlung, bereiten Sie ein Gefäß mit 40 ml BSV. Fügen Tintenfisch zu den Schalen für den Test (maximal n = 40 pro Schale). </li><li> Bereiten Sie eine zusätzliche Schüssel als aposymbiotic (negative) Kontrolle. </li><li> Bereiten Sie einen dedizierten Transferpipette für jede Behandlung. </li><li> Einschläfern Extra Tintenfisch in 2% igem Ethanol. </li></ol> 4. Squid Colonization <ol><li> Tag 2 - Mit einem P10 Pipetman, verzichten die berechnete Aliquot der Bakterien (Schritt 1.5) in jede Schale Tintenfisch (Schritt 3.8) für jede Behandlung. Starten Sie ein 3 h-Timer sofort nachdie ersten Impfung. </li><li> Für jede Behandlung, erstellen Sie einen &quot;Wirbel&quot; in der Schüssel mit dem engagierten Transferpipette, indem Sie die Pipette in der Nähe der Kante der Schüssel und Auf-und Abpipettieren wiederholt, um die Wasser-und Tintenfisch für ca. 10 Sek. mischen. Die Durchmischung ist kritisch. </li><li> Tafel 50 ul aus jeder Schüssel auf einen LBS-Agar-Platte aus Schritt 2.2 (für technische Replikate, Platte zwei 50 ul Platten pro Behandlung). Inkubation bei 25-28 ° C über Nacht. </li><li> Bereiten Waschschüsseln (100 ml BSV / EA) für jede Behandlung. </li><li> Bereiten Drosophila Fläschchen (4 ml BSV / EA) für jeden Tintenfisch. </li><li> Nach genau 3 h, überweisen Sie den Tintenfisch zu ihren jeweiligen Waschschüsseln (komplette Behandlung für alle). Dies hält die Impfung. </li><li> Gehen Sie jedes einzelne Tintenfisch seine eigene Drosophila Fläschchen mit BSV übertragen. Verwenden Sie einen bestimmten Transferpipette für jede Behandlung. </li><li> Bewegen Tabletts von Drosophila Fläschchen an den squid Möglichkeit, auf den Tag / n zurückight Lichtzyklus die Tiere erlebt während der Embryogenese. </li><li> Tag 3 - Prepare Drosophila Fläschchen (4 ml BSV / EA) für jeden Tintenfisch. </li><li> Vor Einbruch der Dunkelheit bei 22-24 h nach der Inokulation übertragen jedes Tintenfisch zu einem neuen Drosophila-Fläschchen. Verwenden Sie einen bestimmten Transferpipette für jede Behandlung. </li><li> Tag 4 - Bereiten Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (1/squid) markiert. </li><li> Vor Einbruch der Dunkelheit bei 46 bis 48 h nach der Inokulation, messen und notieren Sie die Lumineszenz der einzelnen Tintenfisch im Drosophila-Fläschchen (Luminometer-Set für 6 s Integration und auf Deckelverschluss Auto-lesen). </li><li> Als negative Kontrolle für Hintergrundlumineszenz, messen Sie ein Fläschchen mit, die BSV enthält keine Tintenfische. </li><li> Übertragen Sie jede Tintenfisch in einem Volumen von etwa 700 ul einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 4.12. Gehen Sie zu einem Karton Tiefkühler. Sobald der Deckel auf den Kasten gelegt wird, entfernen Sie es nicht wie die Licht Cues für Bakterien Vertreibung sind nicht WELl-verstanden. </li><li> Freeze Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C über Nacht. </li></ol> 5. Bestimmung von Colonization Levels <ol><li> Für jeden Tintenfisch, bereiten zwei (2) Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 475 ul BSV (oder autoklaviert 70% Instant Ocean). </li><li> Bereiten Stößel indem Sie zuerst eine Kimwipe den Stößer sauber und entfernen Sie groben Schmutz und / oder Gewebe. </li><li> Platz Stößel Spitze nach unten in einem 50 ml Becherglas mit 95% Ethanol. Ethanol sollte in einer Höhe von etwa 3 cm, hinzugefügt werden. </li><li> Für jeden Stößel, aus dem Becher zu entfernen, und wischen Sie die Spitze mit einem Kimwipe. </li><li> Tauchen Sie ein Stößel zurück in den Ethanol-Bad, Ziehen und Stecken (Spitze nach oben) in ein Mikrozentrifugenröhrchen Rack und lassen Sie sie vollständig trocknen Luft für etwa 15 Minuten. </li><li> Tauwetter Tintenfisch in einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack (maximal n = 8). </li><li> Falls erforderlich, passen Sie die Lautstärke auf 700 ul. </li><li> Mit einem Stößel aus Schritt 5.5, stören die tierischen Gewebe, bis der Tintenbeutel rupren (das Wasser wird eine trübe graue Farbe drehen). </li><li> Entfernen Sie den Stößel und sicherzustellen, dass alle Gewebe bleibt in der Röhre. </li><li> Vortex das Gewebe kurz für genau 10 Sekunden (verwenden Sie eine Zeitschaltuhr). </li><li> Willkommen das Gewebe für 10 min. Das Gewebe wird niederzulassen und die Bakterien und Tinte in Lösung bleiben. Für die Berechnungen, die folgen, ist die Bakterien / Tusche-Lösung die [A] Verdünnung (dh die E. scolopes Lichtorgel Homogenat in 700 ul). Serielle Verdünnungen 1.20 ([B], [C]) beschrieben. </li><li> Für die [B] Verdünnung, fügen Sie 25 ul [A] zu einem der Reaktionsgefäße in Schritt 5.1 vorbereitet. Vortex. </li><li> Für die [C] Verdünnung, fügen Sie 25 ul [B] zu einem der Reaktionsgefäße in Schritt 5.1 vorbereitet. Vortex. </li><li> Tafel 50 ul jeder Verdünnung auf Agar LBS, repliziert 2 pro Behandlung. </li><li> Die Inkubation bei 25-28 ° C über Nacht. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Um die KBE / Lichtorgel (LO), Länder berechnent Kolonien auf der Platte für jede Behandlung, in denen 10 bis 400 Kolonien vorhanden sind, und verwenden Sie die entsprechende Formel: KBE / LO = (Kolonien auf [A] Platte) x 14; oder KBE / LO = (Kolonien auf [B] Platte) x 280; oder KBE / LO = (Kolonien auf [C] Platte) x 5600. </li><li> Zeichnen einzelne Datenpunkte und Mediane auf einer logarithmischen Skala. </li><li> Die Daten werden oft nicht normal verteilt, mit unterschiedlichen Varianzen, und die Ausreißer können biologisch sinnvoll Informationen enthalten. Deshalb bieten nicht-parametrischen Tests eine nützliche Methode, um festzustellen, ob die Behandlungen signifikant unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie GraphPad Prism Software für statistische Analysen. Für zwei Behandlungen, verwenden Sie den Wilcoxon-Rangsummentest. Für Vergleiche zwischen mehr als zwei Behandlungen, verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test mit den entsprechenden Post-Tests. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Ergebnisse aus einer Probe Kolonisierung Tests sind in 4 gezeigt. Zwei Stämme von <em&gt; V. fischeri, die verschiedene Ebenen der relativen Lumineszenz zeigen wurden jeweils in sechs squid eingeimpft, zusammen mit sechs Tintenfische, die als aposymbiotic (unbesiedelten) Kontrollen dienten. Die E. scolopes Symbionten, ES114 14, und desto heller Sepiola Robusta-Symbionten, SR5 15,16. Ähnliche Inokulumdichten (4A) und 100% Kolonisierung führen innerhalb von 3 h. Nach 48 h wurden die Lumineszenz Ebenen (4B) und Keimzahlen (4C) bestimmt, um die Besiedelung Kenntnisse des Stammes zu bewerten. Bestimmung der spezifischen Lumineszenz (4D; pro Bakterium) ermöglicht die Bestimmung der Helligkeit von jedem Bakterienstamm während der Symbiose. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema des Verfahrens Kolonisation. Bakterien und Tintenfische werden separat geerntet dann an der angegebenen Inokulum vermischt. Squid gewaschen werden, dann neues Wasser nach 3 h, 24 h und 4 übertragen<html> 8 h nach der Inokulation. Nach 48 h wurde die Lumineszenz gemessen wird und die Tiere werden eingefroren, dient die Oberfläche zu sterilisieren die Tiere. Light-Orgel Bakterien besiedelt bleiben bei -80 ° C lebensfähig durch ein Tauwetter (keine zusätzlichen Frost-Tau-Zyklen). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flussdiagramm, Homogenisierung und Verdünnungsausstrichtechnik der Bakterien. Serielle 20-fache Verdünnungen den geeigneten dynamischen Bereich für die Zählung von Bakterien besiedelt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig3.jpg" /> Abbildung 3. Transferpipetten mit einem entsprechend schmalen Schacht verjüngen sich zu einer engen Bohrung (A), die juvenile Tintenfisch beschädigen würde. Vorbehandlung durch das Abschneiden der engsten Stelle mit einer Schere oder einer Rasierklinge liefert ein geeignetes Werkzeug (B) für die Übertragung von jugendlichen Tintenfisch. s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Sample-Daten für eine Kolonisierung Assay. (A)-Spiegel von den Bakterien im Inokulum Schüsseln. (B) Lumineszenz einzelner Tintenfisch. (C) Koloniezählungen einzelner Tintenfisch. (D) besondere Lumineszenz einzelner Tintenfisch. Apo, Aposymbiotic (unbesiedelten Negativ-Kontrolle).

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	<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity.">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li><li>Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215-218 (2009).</li><li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+microbiome.">The skin microbiome.</a> Nat. Rev. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+amino+acids+support+the+proliferation+of+symbiotic+bacteria.">Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).</li><li>Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+squid+that+glows+in+the+night:+development+of+an+animal-bacterial+mutualism.">A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism.</a> J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).</li><li>Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hawaiian+bobtail+squid+(Euprymna+scolopes):+a+model+to+study+the+molecular+basis+of+eukaryote-prokaryote+mutualism+and+the+development+and+evolution+of+morphological+novelties+in+cephalopods.">The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+fischeri-Euprymna+scolopes+symbiosis:+a+model+marine+animal-bacteria+interaction.">The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction.</a> Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).</li><li>Boettcher, K. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+light+emission+by+symbiotic+Vibrio+fischeri+of+the+sepiolid+squid+Euprymna+scolopes.">Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes.</a> J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).</li><li>Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+niche+for+Vibrio+logei,+the+predominant+light+organ+symbiont+of+squids+in+the+genus+Sepiola.">A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola.</a> J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).</li><li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+rapid+evolution+of+the+luxR-luxI+intergenic+region+to+the+diverse+bioluminescence+outputs+of+Vibrio+fischeri+strains+isolated+from+different+environments.">Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Kolonisierung beschriebene Assay ermöglicht die Analyse einer natürlichen symbiotischen Prozess, in einer kontrollierten Laborumgebung. Als solche kann sie verwendet werden, um die Besiedlung durch Mutantenstämmen, die von verschiedenen natürlichen Isolaten und unter unterschiedlichen chemischen Regime zu beurteilen. Variationen der beschriebenen Experimente werden üblicherweise verwendet, um verschiedene Aspekte der Symbiose zu bewerten. Die Kinetik der Kolonisierung ist anhand von Lichtemission während der e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Glass Kultur Tubes, 16 mm Durchmesser </td><td> VWR </td><td> 47729-580 </td><td></td></tr><tr><td> Caps für Kultur Glass Tubes </td><td> Fischer </td><td> NC9807998 </td><td></td></tr><tr><td> Visible Spektralphotometer zur Bestimmung der OD 600 </td><td> Biowave </td><td> CO8000 </td><td> Jede Spektrophotometer für die Messung OD 600 funktionieren wird. Dieses Gerät kann die OD 600 von Flüssigkeit direkt zu messen in der Glas-Kulturröhrchen. Einige Einstellung des Inokulums Berechnung kann erforderlich sein, je nach dem verwendeten Instrument. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 Einzel-Tube Luminometer </td><td> Promega </td><td> E5311 </td><td> Entspricht der Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Enthält die Mikrozentrifugenröhrchen Halter. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 Light Standard </td><td> Promega </td><td> E5341 </td><td> Für Luminometer Kalibrierung. </td></tr><tr><td> Refraktometer, Handheld </td><td> Foster and Smith Wassersport </td><td> CD-14.035 </td><td> Kalibrieren Sie vor jedem Gebrauch mit entionisiertem Wasser. Spülen Sie nach jedem Gebrauch mit deionisiertem Wasser auf Salz zu verhindern Aufbau. </td></tr><tr><td> Instant Ocean (künstlichem Meerwasser-Konzentrat) </td><td> Foster &amp; Smith Wassersport </td><td> CD-16.881 </td><td> Bereiten Sie bei 35 ‰ in VE-Wasser, mit dem Refraktometer, filtriert dann über einen 0,2 um Filter SFCA. </td></tr><tr><td> Filtrationseinheit </td><td> Nalgene </td><td> 158-0020 </td><td> Tensidfreie Celluloseacetat (SFCA)-Membran, 0,2 um. Wir haben unterschiedliche Ergebnisse mit einigen tensidhaltigen PES Filter beobachtet. </td></tr><tr><td> Transferpipetten </td><td> Fischer </td><td> 13-711 -09.00 Uhr </td><td> Mit einer Schere oder Rasierklinge, schneiden Sie die Spitze sauber über dem ersten Grat, den Durchmesser der Pipettenspitze zu erhöhen und zu vermeiden Zusammendrücken der Tintenfisch Schlüpflinge. </td></tr><tr><td> Einweg Probeschälchen (Plastikbechern) </td><td> Komet </td><td> Von T9 (9 oz.) </td><td> Schalen für die Impfung, mit oberer Durchmesser 3 ¼ &quot;, unterer Durchmesser 2 ¼&quot;, Höhe 3 &quot;. Bowls schaffen eine homogene Umgebung, da sie keinen unteren Rand, in dem Tintenfisch in einer sauerstoffarmen Nische gefangen nicht bekommen können. Die Größe wird optimiert für 40-ml Inokulum. Verfügbar unter webstaurantstore.com, # 619PI9. </td></tr><tr><td> Drosophila-Vials </td><td> VWR </td><td> 89092-720 </td><td> Vial Durchmesser entspricht der Öffnung auf dem Luminometer PMT. </td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> ISC Bioexpress </td><td> C-3217-1CS </td><td> Rohre müssen passen die Form der Stößel. </td></tr><tr><td> Ethanol, 200 Proof </td><td> Fischer </td><td> BP2818-100 </td><td></td></tr><tr><td> Pistille </td><td> Kimble Chase / Kontes </td><td> 749521-1500 </td><td></td></tr><tr><td> Plating Perlen, 5 mm Durchmesser </td><td> Kimble Chase </td><td> 13500 5 </td><td> Bereiten Sie 5 pro Rohr und Autoklaven. </td></tr></tbody></table>

colonization of euprymna scolopes squid by vibrio fischeri

Spezielle Bakterien werden in Zusammenarbeit mit tierischem Gewebe 1-5 gefunden. Solche Wirt-Bakterien-Assoziationen (Symbiosen) kann schädlich sein (pathogene), haben kein Fitness-Folge (Kommensalen), oder von Vorteil sein (mutualistic). Während viel Wert wurde auf pathogene Interaktionen gegeben wurde, ist wenig über die Prozesse, die die reproduzierbare Erfassung von nützlichen / symbiotischer Bakterien aus der Umwelt zu diktieren bekannt. Die Lichtorgan Mutualismus zwischen der marinen Gram-negative Bakterium V. fischeri und die hawaiianische Bobtail Tintenfisch, E. scolopes, stellt eine sehr spezifische Interaktion, in denen ein Wirt (E. scolopes) stellt eine symbiotische Beziehung mit nur einer Bakterienart (V. fischeri) im Laufe seiner Lebensdauer 6,7. Biolumineszenz von V. produziert fischeri in dieser Interaktion ist daher ein Anti-Verdrängung Vorteil E. scolopes bei nächtlichen Aktivitäten 8,9, währenddas nährstoffreiche Wirtsgewebe stellt V. fischeri mit einer geschützten Nische 10. Während jeder Host-Generation wird diese Beziehung rekapituliert und damit zu einer vorhersehbaren Prozess, der im Detail in verschiedenen Stadien der Entwicklung symbiotische beurteilt werden kann. Im Labor der Jugendliche Tintenfisch Luke aposymbiotically (unbesiedelten), und, wenn innerhalb der ersten 30-60 Minuten gesammelt und an Symbionten-freies Wasser, kann nur durch die experimentelle Inokulum 6 besiedelt werden. Diese Wechselwirkung bietet daher ein nützliches Modell, bei dem die einzelnen Schritte, die für bestimmte Erwerb einer symbiotischen Mikroben aus der Umgebung 11,12 führen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Grad der Kolonisierung, die beim neu geschlüpften aposymbiotic E. tritt bewerten scolopes werden (künstliche) mit Meerwasser ausgesetzt V. fischeri. Dieser einfache Test beschreibt Inokulation natürlichen Infektion und Erholungder bakteriellen Symbionten aus dem im Entstehen begriffenen Lichtorgel von E. scolopes. Es wird darauf geachtet, um eine konsistente Umgebung für die Tiere während symbiotische Entwicklung zu sorgen, insbesondere im Hinblick auf die Wasserqualität und Licht Cues. Methoden, um die symbiotische Bevölkerung beschrieben charakterisieren, gehören (1) Messung von Bakterien stammende Biolumineszenz, und (2) direkte Zählung der Kolonie erholte Symbionten.

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Die Methode beschreibt das Verfahren, mit dem die Hawaiian Bobtail Squid,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Und ihre bakteriellen Symbionten,<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt;, Werden getrennt und dann eingeführt werden, um für spezifische Besiedlung des Tintenfisches Lichtorgel von den Bakterien ermöglichen angehoben. Colonization Erkennung von Bakterien stammende Lumineszenz und durch direkte Auszählen von Kolonien werden beschrieben.

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

colonization-of-euprymna-scolopes-squid-by-vibrio-fischeri

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

19.8K Aufrufe.  Northwestern University. Die Methode beschreibt das Verfahren, mit dem die Hawaiian Bobtail Squid, Euprymna scolopes Und ihre bakteriellen Symbionten, Vibrio fischeri, Werden getrennt und dann eingeführt werden, um für spezifische Besiedlung des Tintenfisches Lichtorgel von den Bakterien ermöglichen angehoben. Colonization Erkennung von Bakterien stammende Lumineszenz und durch direkte Auszählen von Kolonien werden beschrieben.

Serie: Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch 1 H-NMR-Spektroskopie

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

TransFLP &amp;#x2014; A Method to Genetically Modify &lt;em&gt;Vibrio cholerae&lt;/em&gt; Based on Natural Transformation and FLP-recombination

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Methods Article

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri