Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis strahlungsinduzierter Brennpunkte von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl. Die Immunfluoreszenz-Bildgebung ist eine empfindliche Methode und liefert visuelle Beweise für das Auftreten von Reparaturwegproteinen in Brennpunkten als Reaktion auf DNA-schädigende Mittel wie ionisierende Strahlung. Neutronenmischer Strahl wird in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie BNCT verwendet, und die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion ist noch nicht vollständig nachgewiesen.
Unser Protokoll kann auch für die Analyse biologischer Effekte auf zellulärer Ebene aufgrund von Strahlung durch andere High-LET-Strahlen nützlich sein, wie Protonen mit Protonenstrahltherapie oder Kohlenstoffionen mit Hadrontherapie. Nach der Bestrahlung das Medium aus den angeschlossenen Zellen entfernen und einmal mit 2,5 Milliliter PBS waschen. Dann fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 70%Ethanol für 10 Minuten.
Um die Zellen zu durchdringen, entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie es mit 2,5 Milliliter PBS. Fügen Sie vorsichtig einen Milliliter 2%Triton X-100 in PBS hinzu, um die Abdeckungen zu decken, und brüten Sie die Zellen für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, und blockieren Sie die Permeabilisierung mit einem Milliliter von 2%BSA in PBS verdünnt.
Dann inkubieren Sie die Zellen für mindestens 30 Minuten mit der 2%BSA. Um die Zellen zu färben, fügen Sie die richtige Menge an primärem Antikörper hinzu, der in PBS mit BSA verdünnt wird, wie im Textmanuskript empfohlen. Dann bedecken Sie die Petrischale und legen Sie sie in eine Plastikbox mit feuchtigkeitsbefeuchteten Lignin, um feuchtigkeit zu halten.
Inkubieren Sie es für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Führen Sie nach der Inkubation drei Wäbungen mit PBS durch und fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu. Bringen Sie die Schale mit feuchtigkeitsbefeuchteten Lignin in die Plastikbox zurück und brüten Sie sie mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius an.
Wiederholen Sie dann die Wässen mit PBS, und fügen Sie 100 Mikroliter DAPI verdünnt zu einer endletzten Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter, um die Kerne zu konstainieren. Inkubieren Sie die Zellen für maximal zwei Minuten bei Raumtemperatur, und wiederholen Sie die Waschungen mit PBS. Nach der letzten Wäsche entfernen Sie die PBS, und legen Sie vorsichtig einen Deckelrutsch auf das Montagemedium, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Versiegeln Sie die Kanten des Deckels mit Nagellack und lassen Sie das Montagemedium aushärten, bevor Sie die Fluoreszenzmikroskopie durchführen. Gamma-H2AX-Foci, Standardmarker für DNA-Doppelsträngige Brüche, wurden in neutronengemischten, strahlbestrahlten und nicht bestrahlten Darmkrebszellen nachgewiesen. Die Brennpunkte erscheinen als deutliche fluoreszierende Punkte.
Ein höherer Durchmesser von Gamma-H2AX-Brennpunkten wurde in den bestrahlten Zellen beobachtet. Darüber hinaus wurde eine einspurige Spur eines High-LET-Alpha-Teilchens über die Kerne nachgewiesen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um repräsentative Reparaturproteine Rad52 und DNA-abhängige Proteinkinase zu detektieren.
Ein hoher Mittelwert des DNA-abhängigen Proteinkinase-Foci-Durchmessers wurde bei DNA-Breaks nach Bestrahlung im Vergleich zu Kontrollzellen gemessen. Clustered DNA doppelsträngige Brüche wurden in bestrahlten Zellen als komplexere, größere und gruppierte Brennpunkte mit höherer Intensität beobachtet. Das wichtigste Stadium der Immunfluoreszenzfärbung ist die Fixierung von Zellen und die Permeabilisierung der Zellmembran.
Diese Schritte sind erforderlich, damit Antikörper leicht sowohl in diese Zellen als auch in intrazelluläre Reparaturproteine eindringen können. Dieses Verfahren gibt Informationen über die Aktivierung jedes Reparaturwegs auf zellulärer Ebene. Die Ergebnisse sollten dann auf molekularer Ebene mit einem Assay, wie Z. B. Echtzeit-PCR, bestätigt werden.
Diese Technik ermöglicht es Forschern, die strahlungsinduzierte Reaktion auf DNA-Schäden zu erforschen, die bei verschiedenen Strahlen mit Anti-Krebs-Therapien noch nicht vollständig bestimmt wurde.
