Indirekte Immunfluoreszenz ermöglicht den Nachweis von DNA-Reparaturproteinen, Fotos von räumlicher und zeitlicher Rekrutierung und hilft bei der Verhör von Proteinprotein-Wechselwirkungen an der Stelle von DNA-Schäden. Nach DNA-Schäden werden DNA-Reparaturproteine zur DNA-Beleidigung rekrutiert, während ihre Konzentration lokal zunimmt, und sie bilden Gruppen, die als Brennpunkte bezeichnet werden und durch indirekte Immunfluoreszenz an festen Proben visualisiert werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um Protein-Schwerpunkte zu erkennen, sowie um die Kolokalisierung der Gegenwart in Zellen zu quantifizieren.
Dies kann helfen, die Abfolge der Ereignisse zu erklären, die für komplexe Bildung und DNA-Reparatur erforderlich sind. aus solchen Experimenten können besondere Proteinprotein-Wechselwirkungen entstehen. Demonstriert wird das Verfahren von Barbara De La Pena, einem sehr talentierten Postdoc-Foto aus meinem Labor Begin, indem es 40.000 HeLa-Zellen in jeder weit über 12 Wellplatte mit einem 18-Millimeter-Rundglasdeckel zu 80% Konfluenz anwächst.
Nachdem Sie die Zellen vier grauen Gammabestrahlungen aussetzen, waschen Sie sie zweimal mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie dann die PBS vollständig und fügen Sie 200 Mikroliter NDB zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann die NDB.
Beachten Sie, dass die Inkubationszeit je nach Zelllinie variieren kann, aber in der Regel zwei Minuten nicht überschreiten sollte. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie dann die PBS vollständig und fügen Sie 200 Mikroliter 4%PFA zu jedem Brunnen für die Zellfixierung hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann die PFA und fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter PBS hinzu. Entfernen Sie PBS vollständig und fügen Sie dann 200 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius.
den primären Antikörper und Verdünnungspuffer verdünnen und wirbeln, bis er gut in einer Feuchtigkeitsbox vermischt ist, und hier ein Stück Parafilm und fügen Sie 10 Mikroliter Primärantikörper in einem einzigen Tropfen hinzu. Richten Sie eine Kante des Deckels aus dem Brunnen mit dem Tropfen aus und senken Sie ihn langsam auf den Parafilm, der die Flüssigkeit ausbreitet. den Deckelrutsch für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation waschen Sie die Abdeckung rutscht dreimal in PBS für eine Minute pro Wäsche. den sekundären Antikörper und Verdünnungspuffer verdünnen und so lange verdünnen, bis gut vermischt 10 Mikroliter Sekundärantikörper auf jeden Deckelschlupf auftragen, wie zuvor beschrieben, und inkubieren Sie ihn für zwei Stunden bei lichtgeschützter Raumtemperatur. Waschen Sie die Abdeckung rutscht dreimal mit PBS und einmal mit Wasser für eine Minute pro Wäsche.
Dann montieren Sie sie auf Glasschlitten mit einem Glyzerin-basierten Montagemedium mit DAPI-Dichtungsabdeckungsschlipsen mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie 20 Minuten trocknen. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die 60 x Objektivlinse und verwenden Sie DAPI, um die Kerne durch das Okular für die XYZ-Bildaufnahme zu lokalisieren, die Erfassungssoftware zu öffnen und den Scannertyp als galvano den Scannertyp als Roundtrip und 512 x 512 Bildgröße einzustellen. Im PMT-Bedienfeld modus auf VBM Durchschnitt auf Frame und sequenzielle Scan to Line.
Als nächstes stellen Sie die Farbstoffe und Wärmedetektoren Kanal eins auf DAPI und SD eins, Kanal zwei auf alexafluor 488 und HSD drei und Kanal drei auf alexafluor bei 647 und HSD vier wählen Sie auf Z.To das Live-Bild einzustellen, drücken Sie die Live-Taste auf dem Live-Fenster und den Fokus einstellen. Verwenden Sie dann das PMT-Werkzeugfenster, um die Laserintensitätsempfindlichkeit, Verstärkung und Versatz Einstellung Für z-Stacks, Start-to-Ende und 15 Slices festzulegen. Wählen Sie den Ordner aus, um Bilder zu speichern, und drücken Sie die LSM-Starttaste, um mit dem Erfassen zu beginnen.
Wenn Sie fertig sind, drücken Sie die Taste "Serie getan", um die Bildaufnahme abzuschließen. Öffnen Sie die Analysesoftware, drücken Sie dann das Batch-Tool-Fenster und wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus. Wechseln Sie zum Analysewerkzeugfenster, und wählen Sie die Projektion aus, die die maximale Intensitätsprojektion aus 15 Slices anzeigt.
Wählen Sie unter der Eingabeausgabeeinstellung den erstellten Stapel und den Ausgabeordner aus. Drücken Sie den Prozess, um Bilder zu verarbeiten, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Führen Sie die kerntechnische Quantifizierung mit zellprofiler nach Manuskriptrichtungen durch.
Zellen, die nicht mit der Strahlung behandelt werden, weisen nur sehr wenige Gamma-H2AX-Expozeichen auf. In Ermangelung wesentlicher DNA-Reparaturproteine kann die Gamma-H2AX-Akkumulation bei DNA-Brüchen beobachtet werden. Die Akkumulation von nicht reparierten Brüchen kann dazu führen, dass Zellen durch feste Gamma-H2AX-Kerne vor hypotonisch werden.
Nach der Bestrahlung weisen Die Kerne eine große Anzahl von Doppelsträngigenaufbrüchen auf, zu denen Gamma H2AX extrem schnell lokalisiert. Während in Ermangelung einer Strahlung nur wenige, wenn überhaupt, Brennpunkte beobachtet werden, wurde die Anzahl der Brennpunkte bei zwei vier und 16 Stunden nach einer Strahlung und für die NOA-Strahlungskontrolle quantifiziert. Abhängig von der erhobenen biologischen Frage und der Art der erforderlichen Daten sollten verschiedene Darstellungsoptionen als Kolokalisierung betrachtet werden, die durch Multiplexieren primärer Antikörper untersucht werden kann, die in verschiedenen Tierarten aufgezogen werden und sekundäre Antikörper verwenden, die mit ausgeprägten Fluorophoren gekennzeichnet sind.
Überlagerung von grün und rot, führt zu gelben Hotspots, die beiden Proteine von Interesse sind in den gleichen Pixeln vorhanden. Quantitative Analysen der Kolokalisierung können durch einen objektbasierten Ansatz oder durch einen statistischen Ansatz erreicht werden, der auf einer Intensitätskorrelationskoeffizienten-basierten Analyse basiert. Eine Kombination von primären Antikörpern, die in verschiedenen Tierarten aufgezogen werden, kann in diesem Protokoll verwendet werden.
Stellen Sie sicher, dass die Antikörper kompatibel sind und sich nicht gegenseitig stören. Sie müssen den sekundären Antikörper, der gegen jeden der primären Antikörper verwendet werden soll, entsprechend einstellen und bei der Auswahl der weniger zu verwendenden Kraft eine bestimmte spektrale Überlappung berücksichtigen. Kolokalisierung oder Proteine weisen auf mögliche direkte Wechselwirkungen hin.
Dies kann durch granulare Ausfällung in Zellen oder durch direkten Absetzen mit gereinigten Proteinen in vitro überprüft werden.
