Diese Methode adressiert die Herausforderungen bei der Tiefenfluoreszenzbeobachtung in Reistrieben, wie eine begrenzte Gewebepenetration der Clearing-Lösung und die reale Auflösung unter konfokalem Mikroskop. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Strukturbeobachtung von viel großen Geweben aus einer Makroperspektive, sogar Aufforderungen mit harten und dicken Geweben, wie erwachsenen Trieben. Diese Methode gilt für die tiefe Bildgebung von hartem und dickem Gewebe in breiten Pflanzenarten.
Es kann dazu beitragen, die Entdeckung neuer Phänomene in der pflanzenbiologischen Forschung zu beschleunigen. Schneiden Sie zunächst die Wurzeln vorsichtig, ohne die Pflanzen zu beschädigen, und waschen Sie sie mit Wasser, um den Schmutz zu entfernen. Verwenden Sie nun eine Pinzette, um die alten äußeren Blätter abzuschälen.
Um zu vermeiden, dass die Zellen zerquetscht werden, verwenden Sie ein einschneidiges Rasiermesser mit einer Gleitbewegung, um das Gewebe vom Spross, apikalen Meristem oder jungen Rispe zur Basis zu schneiden. Wenn die Position des apikalen Meristems oder der jungen Rispe nicht sichtbar ist, schneiden Sie es länger. Der Reistrieb hat einen ovalen Querschnitt.
Verwenden Sie einen zweischneidigen Rasierer, um eine Seite des Ovals dünn in Richtung seiner Längsachse abzurasieren. Bestätigen Sie die Position des apikalen Meristems oder der jungen Rispe durch das Auftreten einer weißlichen Farbe in der Probe und schneiden Sie das überschüssige Gewebe ab. Die Probe wird in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das einen Milliliter Fixierlösung enthält.
Schneiden Sie ein 2,5 Quadratzentimeter großes Stück Paraffinfolie und formen Sie es zu einer Kugel. Legen Sie nun diese Kugeln auf die Proben, um zu verhindern, dass sie aus der Fixierlösung herausschwimmen. Legen Sie das Röhrchen mit der Probe in einen Exsikkator.
Schließen Sie den Deckel des Exsikkators und starten Sie die Vakuumpumpe, um das Innere des Exsikkators langsam unter Druck zu setzen, bis ein Druck von minus 0,095 Megapascal erreicht ist. Nach dem Schließen des Exsikkators bei minus 0,095 Megapascal schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Öffnen Sie den Exsikkator leicht und bringen Sie ihn langsam wieder auf Atmosphärendruck.
Wenn die Probe richtig fixiert ist, sinkt sie in die Fixierlösung. Und wenn es nicht sinkt, reduzieren Sie den Druck wieder. Entfernen Sie den Paraffinfilm.
Schließen Sie den Deckel und halten Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die überschüssige Fixierlösung mit fusselfreien Tüchern aus der Probe und fixieren Sie die Probe mit Sofortkleber auf einer vibrierenden Mikroschneidemaschine. Legen Sie die Probe auf ein Tablett mit der flachen Seite nach unten, das während der Probenahme abrasiert wurde, und stellen Sie die Schnittbedingungen entsprechend der festgelegten Probe ein.
Stellen Sie die Probenposition mit der Rückwärts- oder Vorwärtstaste und der Aufwärts- oder Abwärtstaste ein und füllen Sie das Fach mit entionisiertem Wasser, bis alle Proben eingetaucht sind. Drücken Sie nach dem Befüllen des Fachs die Starttaste und legen Sie die zugeschnittenen Proben mit einem Tropfen PBS auf einen Glasobjektträger. Überprüfen Sie die Probe, die die Zielstelle enthält, unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie die zugeschnittene Probe auf eine Multiwell-Platte mit einem Milliliter PBS.
Entfernen Sie das PBS von der Multiwell-Platte. Fügen Sie frisches PBS hinzu und lassen Sie es eine Minute stehen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie die CS hinzu. Legen Sie die Multiwell-Platte mit der Probe in einen Exsikkator und schließen Sie den Deckel.
Starten Sie dann die Vakuumpumpe, um das Innere des Exsikkators langsam bis minus 0,09 Megapascal zu entlasten. Nach dem Schließen des Exsikkators bei minus 0,09 Megapascal schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Öffnen Sie den Exsikkator leicht und bringen Sie ihn langsam wieder auf Atmosphärendruck.
Gießen Sie entionisiertes Wasser in den Spalt zwischen den Brunnen, um die Verdunstung des CS zu verhindern, und lagern Sie die Multi-Well-Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln zur Reinigung. Wenn der CS grün wird, ersetzen Sie ihn durch eine neue Lösung. Die unbeschnittenen Proben blieben grün und wurden nach dreimonatiger Behandlung nicht transparent, wobei die CS.In Proben, die von allen Blättern abgezogen wurden, nach einer Woche weiß wurden, obwohl die Knoten grün blieben.
Die Probe wurde nach vier Wochen nicht transparent. Die handgetrimmten Proben wurden nach einer Woche CS-Behandlung weiß, aber nach vier Wochen nicht transparent. Die auf 130 Mikrometer Dicke zugeschnittenen Proben wurden nach einer Woche CS-Behandlung durchscheinend.
Die Probe war nach zwei Wochen nahezu transparent. Im Knoten betrug die beobachtbare Tiefe nach einer Woche der CS-Behandlung minus 60 Mikrometer und nach zwei Wochen minus 90 Mikrometer. Fluoreszierende Signale wurden in einer Tiefe von minus 80 Mikrometern nach drei Wochen und in einer Tiefe von minus 100 Mikrometern nach vier Wochen beobachtet.
Im Internodium wurden ohne CS-Behandlung fluoreszierende Signale in einer Tiefe von minus 60 Mikrometern beobachtet. Die beobachtbare Tiefe betrug minus 90 Mikrometer nach einer Woche bis drei Wochen der CS-Behandlung und minus 100 Mikrometer nach vier Wochen. In den Blättern wurden fluoreszierende Signale in einer Tiefe von minus 90 Mikrometern ohne CS-Behandlung beobachtet, aber die Helligkeit war schwächer als in anderen Geweben.
Nach einer Woche waren die Signale heller und wurden in einer Tiefe von minus 120 Mikrometern beobachtet. Die Expression des Transkriptionsfaktors OS MASU 15 mOrange wurde in jungen Rispen, Blättern, Knoten, Internodien und Fleurette beobachtet. Der Schlüssel liegt darin, die besten Bedingungen für die Pflanzen oder Gewebe zu finden, z. B. Perioden- und Vakuumdruck oder Position sowie CS-Behandlung, Timing, Dicke, Geschwindigkeit und geeignete Färbelösung.
Die Kombination von Timing- und Härtungstechnologie ermöglicht die räumliche zeitliche Beobachtung des Genexpressionsmusters und der interzellulären Kommunikation in mehreren Geweben eines einzelnen Abschnitts.
