Dieses Protokoll stellt einen flexiblen Multiplex-Tröpfchen-PCR-Workflow dar, der eine präzise Differential-Leukozytenzählung auf DerGrundlage epigenetischer Methylierungsmarker ermöglicht. Diese Flexibilität kann die Übersetzung von mdPCR in die klinische Anwendung erleichtern. Diese Methode liefert Ergebnisse, die mit immunfluoreszierenden Färbemethoden genau abgefragt werden.
Im Gegensatz zur immunfluoreszenten Färbung erfordert diese Methode jedoch keine frischen Blutproben oder kostspieligen Antikörper. In der hämatologischen Diagnostik kann Differential-Leukozyten als Indikatoren für ein Spektrum von Krankheiten dienen, einschließlich Infektionen, Entzündungen, Anämie und Leukämie, und wird als ein früher prognostischer Krebs-Biomarker betrachtet. Die Demonstration des Verfahrens mit Abdelrahman Elmanzalawy wird Christina Nassif, eine technische Mitarbeiterin unseres Teams am NRC Medical Device Research Centre, zeigen.
Beginnen Sie damit, 20 Mikroliter Proteinkinase K und 400 Mikroliter Lysebindungspuffer mit magnetischen Perlen mit frisch aufgetauten menschlichen peripheren Mononuklezellen in 100 Mikroliter PBS gründlich zu mischen. Legen Sie das Rohr nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur ein bis zwei Minuten auf ein Magnetischer Rack, bevor Sie den Überstand entfernen. Wenn das Rohr vom Magneten entfernt wird, setzen Sie den DNA-Perlenkomplex in 600 Mikroliter Waschpuffer wieder auf, um nicht spezifisch gebundene Perlen zu entfernen.
Legen Sie das Rohr wieder auf den Magneten, um die Entfernung des Überstandes zu ermöglichen, bevor Sie die Zellen in 600 Mikroliter Waschpuffer zwei waschen, wie gerade gezeigt. Nach dem Entfernen des Überstandes lassen Sie das Rohr eine Minute lang lufttrocknen, bevor Sie dem Rohr 100 Mikroliter Elutionspuffer mit gründlicher Durchmischung hinzufügen. Legen Sie dann die Röhre für ein bis zwei Minuten auf das magnetische Rack, um die magnetischen Perlen von der angespielten DNA zu trennen, und übertragen Sie die gereinigte DNA-Lösung in eine neue Röhre.
Für die Bisulfitumwandlung der gereinigten DNA 20 Mikroliter der angespielten DNA-Probe in ein PCR-Rohr übertragen und 130 Mikroliter Umwandlungsreagenz in das Rohr geben. Nach gründlichem Mischen den Rohrinhalt kurz verdrehen und die DNA auf einem thermischen Cycler verstärken. Fügen Sie am Ende des Zyklus 600 Mikroliter Bindungspuffer zu einer Ionenchromatographie-Säule hinzu, die in einem Sammelrohr platziert ist, und fügen Sie die DNA zur Spalte hinzu.
Invertieren Sie das Rohr mehrmals zu mischen, und Zentrifuge für 30 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Entsorgen Sie den gesammelten Durchfluss, und fügen Sie der Spalte 100 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Säule und entsorgen Sie den Durchfluss erneut, wie gezeigt.
Fügen Sie 200 Mikroliter Desulfonationspuffer für eine Inkubation von 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Säule, bevor Sie die Probe zentrifugieren und den Durchfluss entsorgen, wie gezeigt. Als nächstes waschen Sie die Säule zweimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer pro Wäsche. Nach der zweiten Wäsche die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr geben und 100 Mikroliter PCR-Wasser in die Membran der Säule geben.
Dann elute die DNA durch Zentrifugieren der Säule für eine Minute bei voller Geschwindigkeit. Mischen Sie für die Tröpfchenerzeugung einen Mikroliter Bisulfit-konvertierte DNA mit frisch zubereitetem Sonden-Master-Mix in einem PCR-Rohr und sammeln Sie die Probe mit einer kurzen Zentrifugation. Verwenden Sie Spitzenarmaturen, um Einweg-Fluidrohre mit zwei Präzisionsglasspritzen mit 250 MikroliterVolumen zu verbinden.
Und füllen Sie eine Präzisionsglasspritze mit 250 Mikroliter Trägeröl mit 5% Mehltensid und eine Präzisionsglasspritze mit 50 Mikroliter Trägeröl vor. Wenn beide Spritzen geladen sind, 100 Mikroliter der PCR-Mischung in die Spritze des Trägeröls laden und ein Tropfen-Mikrofluid-Gerät auf die Bühne eines aufrechten Lichtmikroskops legen, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ausgestattet ist. Zur Beobachtung und Aufzeichnung der Tröpfchenbildung in Echtzeit legen Sie die Fertigspritzen auf eine programmierbare Spritzenpumpe und verwenden Sie Spitzenunion mit Armaturen, um die Schläuche der Spritzen mit den Schläuchen der jeweiligen Einlasskanäle des Tröpfchens zu verbinden.
Legen Sie die Schläuche vom Auslass des Tröpfchengenerators auf die Innenseite eines 0,5 Milliliter PCR-Rohrs, und stellen Sie den Spritzenpumpendurchfluss auf zwei Mikroliter pro Minute ein, damit sich die Tröpfchengröße stabilisieren kann, bevor die resultierende Emulsion gesammelt wird. Sammeln Sie die Emulsion langsam und vorsichtig von der Oberseite des Rohres und übertragen Sie 75 Mikroliter der Lösung auf ein 200-Mikroliter-PCR-Rohr für den thermischen Zyklus. Bestätigen Sie dann, dass der Ölgehalt in der PCR-Röhre eng mit dem Volumen der dispergierten Phase übereinstimmt, um eine Koaleszenz der Tröpfchen während des thermischen Zyklus zu verhindern, und legen Sie das 200-Mikroliter-Rohr in den thermischen Cycler.
Übertragen Sie die PCR-Emulsion zur Fluoreszenzbildgebung der emulgierten Probe in ein 50 Mikrometer tiefes Borosilikatkapillarrohr mit rechteckigem Profil, um die Anordnung der Tröpfchen in eine eng verpackte Monoschicht für die Bildgebung zu ermöglichen. Nach der Fixierung und Abdichtung der Kapillaren auf einem Mikroskopschlitten laden Sie den Schlitten auf die Bühne des invertierten Mikroskops. Und in der Mikroskop-Bildgebungssoftware wählen Sie acquire und live schnell, um Echtzeit-Kamera-Erfassung zu starten.
Beobachten Sie dann die Probe unter Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Nach der Tröpfchenerzeugung und dem thermischen Radfahren können die Tröpfchen in eine Glaskapillare mit einer Breite von einem Millimeter und einer Höhe von 50 Mikrometern eingeführt werden. Um eine monolayer Verteilung der Tröpfchen zu erhalten, die ideal für die Fluoreszenzbildaufnahme ist, können dann Bilder für jede Wellenlänge aufgezeichnet werden.
Nach der Bildanalyse kann die Fluoreszenzintensität aller Tröpfchen in ihren jeweiligen Fluorophoren dargestellt werden, um den Schwellenwert der positiven und negativen Tröpfchen zu bestimmen. Nach der Identifizierung und Zählung können die Kopien pro Tröpfchen ermittelt werden, und der Prozentsatz der CD3+T-Zellen und CD4+25+regulatorischen T-Zellen kann anhand der methylierten CD3Z- bzw. FOXP3-Kopien in Bezug auf die Kopien pro Tröpfchen der Gesamtenzellen oder des C-losen Gens bestimmt werden. Die Prozentwerte können dann mit denen verglichen werden, die durch Immunfluoreszenz-Bildgebung mit den entsprechenden Antikörpern erreicht werden.
Ich denke, dass die Emulsionsstabilität von der Tröpfchenerzeugung durch die thermischen Zyklus- und finalen Tröpfchenbildschritte entscheidend ist, um präzise, zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierungsergebnisse zu erhalten. MD PCR Anpassung durch maßgeschneiderte PCR-Mix-Formulierung kann für eine Reihe von Anwendungen einschließlich Krebsforschung, Infektionskrankheiten Diagnose und Analytik auf der Einzelzellebene verwendet werden.
