Dieses Protokoll bietet eine Zellkulturplattform, auf der die Eigenschaften der extrazellulären Matrix wie Steifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie kostengünstig und einfach gesteuert werden können. Die Methode ist kostengünstig und erfordert keine spezielle Schulung oder Einrichtungen. Es ist auch kompatibel mit mehreren zellulären Quantifizierungsmethoden wie immunfluoreszierende Färbung und Western Blot.
Diese Technik vermittelt ein mechanistisches Verständnis der Schwann-Zellbiologie. Mit zusätzlichen Einblicken in das Biomaterialdesign für die Regeneration des Nervensystems kann es auf jede verankerungsabhängige Zelle angewendet werden. Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist der Mikrokontaktdruck.
Vor Beginn des Protokolls wird der Mikrokontaktdruck auf substratisch mit einem Florescent verwendet, um das Protein zu markieren, um den endgültigen Druck visuell auf das Muster zu überprüfen. Beginnen Sie mit dem kräftigen Mischen des PDMS-Basiselastomers und der Härtungsmittel mit einer Pipettenspitze, bis Blasen in der Mischung homogen dispergiert werden. Dann entfernen Sie die Blasen mit Vakuum-Austrocknung.
Legen Sie einen Tropfen der ausgetrockneten PDMS-Mischung auf einen quadratischen oder kreisförmigen Deckel, und drehen Sie den Deckelaufschlag auf einem Spincoater auf 2 500 U/min für 30 Sekunden. Inkubieren Sie den Deckel entweder in einem Ofen bei 60 Grad Celsius, für ein bis zwei Stunden oder bei Raumtemperatur über Nacht. Um ein mikrogemustertes Substrat herzustellen, legen Sie einen gemusterten Siliziumwafer in eine kreisförmige 150 Millimeter Durchmesser von 15 Millimeter Höhe Petrischale und gießen Entgasung PDMS auf den Wafer.
Erstarrte das PDMS in einem Ofen bei 60 Grad Celsius über Nacht. Lassen Sie das PDMS auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie dann ein chirurgisches Skalpell, um Stempel von 30 mal 30 Millimeter Quadraten zu schneiden, die die richtigen Muster enthalten, wobei darauf geachtet wird, den Siliziumwafer nicht zu beschädigen.
Sterilisieren Sie die PDMS-Stempel und abstimmbaren Deckelzettel, indem Sie sie 30 Minuten lang in 70% Ethanol eintauchen. Um die Wirksamkeit des Mikromusters zu bestätigen, trocknen Sie die Oberfläche der PDMS-Stempel mit einem gefilterten Luftstrom und einer Pipette mit 15 Mikrogramm pro Milliliter BSA-Lösung, um die gesamte gemusterte Seite des Stempels abzudecken. Inkubieren Sie die Stempel mit der BSA-Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen, und trocknen Sie dann die Stempel lufttrocken, um die BSA-Lösung zu entfernen.
Verwenden Sie den gefilterten Luftstrom, um die Oberfläche der abstimmbaren Abdeckschlips zu trocknen. Bringen Sie die gemusterte Seite des Stempels in konformen Kontakt mit dem abstimmbaren Deckblatt, um eine BSA-Adsorption auf der Deckslip-Oberfläche zu ermöglichen, und drücken Sie den Stempel vorsichtig fünf Minuten lang gegen den Deckelzettel. Untersuchen Sie das Mikromuster mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter.
Zum Drucken von Zellklebstoffbereichen anstelle von fluoreszierenden Mustern ersetzt Laminin für BSA-Protein. Entfernen Sie die Stempel aus den Deckelscheinen und übertragen Sie die Deckelschlipse in eine sterilisierte Sechs-Brunnen-Platte. Fügen Sie zwei Milliliter 0,2%Pluronische F-127-Lösung in jeden Brunnen ein, um die Oberfläche des Deckschlupfs zu bedecken und die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur zu inkubieren.
Die F-127-Lösung ansaugen und die Abdeckung fünfmal mit PBS waschen, einmal mit dem Zellkulturmedium, säen Sie dann die Schwann-Zellen mit einer Saatdichte von 1000 Zellen pro Zentimeter quadratisch. 45 Minuten nach dem Aussaat der Zelle entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Abdeckungsrutschen zweimal mit PBS, um zu verhindern, dass mehrere Zellen am gleichen Muster haften. Bewahren Sie Zellen in der gewünschten Zellkulturumgebung 48 Stunden vor der Quantifizierung auf.
Um liniengemusterte Zellkultursubstrate für die Untersuchung ausgerichteter Zellen zu erstellen, erstellen Sie die Stempel entsprechend den Manuskriptrichtungen und schneiden sie auf die gewünschten Dimensionen. Bereiten Sie zwei Petrischalen vor, die wie zuvor mit einer abstimmbaren PDMS-Oberfläche beschichtet sind, und führen Sie Mikrokontaktdruck durch, um liniengemusterte Zellklebstoffbereiche auf einem der Gerichte zu drucken. Nach dem Entfernen der Stempel die Petrischale mit vier Millilitern 0,2%Pluronischer F-127-Lösung füllen und eine Stunde lang inkubieren.
Spülen Sie jede Seite der PDMS-Marke dreimal mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit Luft. Drehen Sie die PDMS-Stempel und drucken Sie den ungemusterten Zellklebstoffbereich auf der zweiten Petrischale, wie zuvor beschrieben. Nach dem Inkubieren der Gerichte mit der F-127-Lösung die Lösung entfernen und das Geschirr dreimal mit PBS und einmal mit frischzelligem Kulturmedium waschen.
Dann Samenzellen auf den Tellern, und halten Sie sie zu den gewünschten Bedingungen für 48 Stunden vor der Zubereitung von Lysaten. Um Lysate vorzubereiten, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS für zwei Minuten, fügen Sie dann 80 Mikroliter RIPA-Lösung, die nach den Manuskriptanweisungen zubereitet wird, auf jeden Zellklebstoffbereich ein und inkubieren Sie die Zellen auf einem Eisblock für 25 Minuten. Die Schwann-Zellen mit dem Zellschaber fünf Minuten lang zerkleinern und das Lysat in einem beschrifteten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr sammeln.
Zentrifugieren Sie das Lysat für 15 Minuten bei 12 tausendmal G und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr. Lamininbeschichtete Substrate führten zu einer höheren Proliferationsrate im Vergleich zu Kollagen- und Fibronectin-beschichteten Substraten.
Schwann-Zellen auf Substraten mit Lamininbeschichtung und unterschiedlichen Moduli zeigten, dass relativ weichere Substrate die Zellproliferationsraten verringerten. Die Zellen wurden auch auf Proteinexpression analysiert. Der Transkriptionsfaktor c-Jun-Expression wurde hochreguliert, da Substrate weicher wurden.
Auf den weichsten Substraten wurde es jedoch deutlich nach unten reguliert. Auf steifen Substraten ergaben kollagenbeschichtete Substrate den höchsten c-Jun-Ausdruck, da Substrate weicher wurden, zeigte Laminin die höchsten Konzentrationen von c-Jun. Die Zellen wurden dann mit Rhodaamin-Phalloidin gefärbt, um die Rolle der Zellausbreitung und der Fläche in der c-Jun-Expression zu erforschen.
Beim Erstellen von Zellklebelinien auf den Zellkultursubstraten nahm das Kernwertverhältnis der zellen, die auf dem Mustersubstrat gesät wurden, im Vergleich zu dem von Zellen auf ungemusterten Substraten zu. Die Expression von c-Jun und p75 Neurotrophin-Rezeptor wurden in dichten Zellen mit einem kleineren Verbreitungsgebiet hochreguliert. Liniengemusterte Zellen führten auch zu einer höheren Expression von c-Jun und p75 NTR im Vergleich zu nicht gemusterten Zellen.
Mikrokontakt-gedruckte Zellklebstoffgeometrien wurden entwickelt, um Zellstreufläche und Dehnung präzise zu steuern und gleichzeitig Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu eliminieren. Die Erhöhung des zellulären Seitenverhältnisses führte zu einer Erhöhung der nuklearen Dehnung. Die Expression von c-Jun wurde sowohl durch zelluläre Dehnung als auch durch Zellausbreitungshemmung hochreguliert.
Die Immunfluoreszenzfärbung sowohl für Kerne als auch für Actin bestätigte, dass Zellstreufläche und Dehnung durch diese Mikromustermethode genau kontrolliert wurden. Diese Technik ebnete einen Weg, unsere abstimmbaren Substrate als Methode zur mechanistischen Analyse der Schwann-Zellbiologie und der Signalisierung im Kontext von Regeneration und Krebs zu nutzen.
