Der Autor dankt Doug für seine ständige Ermutigung und unerschütterliche Unterstützung sowie den Mitgliedern des Melton-Labors für ihr hilfreiches Feedback und ihre Kommentare zum Manuskript. Der Autor möchte auch dem Harvard Office of Animal Resources (OAR) für seine engagierte Tierpflege danken.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Protokoll #: 11-32) und AAALAC-Richtlinien an der Harvard University durchgeführt.
1. Vorbereiten von Lösungen und Setup für Anästhesie und Genesung
<ol><li>Bereiten Sie frische 0,1% ige Tricainlösung für die Anästhesie und 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung zur Wiederherstellung vor. Machen Sie die Lösungen mit Wasser für die Axolotl-Haltung37 gemäß den an der jeweiligen Forschungseinrichtung zugelassenen IACUC-Protokollen (z. B. modifizierte Holtfreter-Lösung) geeignet. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen gut gemischt sind und dass genügend Volumen vorbereitet ist, um das gesamte Axolotl einzutauchen.<ol>
<li>Um 0,1% ige Tricainlösung herzustellen, mischen Sie 1 g Tricain und 1 g Natriumbicarbonat mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden.</li>
		<li>Um 0,5% ige Sulfamerazin-Natriumsalzlösung herzustellen, mischen Sie 5 g Sulfamerazin-Natriumsalz mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden. Sulfamerazin-Lösung ist ein Antibiotikum, das eine bakterielle Infektion während der chirurgischen Genesung verhindert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie ihn mit Clidox-S oder 70% Ethanol besprühen. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (Pinzette, Sezierschere, Federschere) durch Autoklavieren. Wenn Sie mehrere Operationen durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie die chirurgischen Werkzeuge mit einem heißen Perlensterilisator zwischen den Tieren sterilisieren.</li>
	<li>Um den Erholungsbereich einzurichten, legen Sie eine 15 cm große Petrischale oder einen beliebigen Behälter, in den der Axolotl passt, auf einen mit Nasseis gefüllten Eimer. Füllen Sie die Petrischale mit einem niedrigen Gehalt von 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung, so dass der Axolotl nicht vollständig untergetaucht wird. Die Erholung auf Eis nach der Operation verlangsamt die Bewegung des Tieres, während es aus der Narkose erwacht, so dass der vernähte Bereich relativ ungestört heilen kann. HINWEIS: Dieses Setup kann von Forschern angepasst werden, je nachdem, welche Materialien sie zur Verfügung haben.</li>
</ol>2. Durchführung des vollständigen chirurgischen Eingriffs des Hautlappens
<ol><li>Anästhesieren Sie den Axolotl, indem Sie ihn in einen Behälter mit 0,1% iger Tricainlösung tauchen. Dies dauert ca. 15-20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass der Axolotl tatsächlich vollständig betäubt ist, indem Sie eine Schwanzprise durchführen. Wenn es keine Reaktion vom Axolotl gibt, fahren Sie mit der Operation fort. HINWEIS: Verwenden Sie für diese Operation ältere, größere Axolotl (mindestens 15 cm groß). Stellen Sie sicher, dass der Axolotl während der gesamten Operation gut hydratisiert bleibt, indem Sie die Haut regelmäßig mit Axolotl-Systemwasser mit einer Kunststoffpipette benetzen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Operationsstelle aseptisch vorbereiten, indem Sie den Bereich vor der Operation mit sterilem PBS bewässern. Das Tier sollte für den Eingriff auch auf einen sterilen chirurgischen Tuch gelegt werden.</li>
	<li>Eine Amputation der Gliedmaßen am distalen Ende der zeugopodialen Skelettelemente wird mit der Sezierschere durchgeführt (Abbildung 1.1).</li>
	<li>Machen Sie mit der Federschere einen kleinen Schnitt (ca. 2 mm) am ventralen Teil der Haut (Abbildung 1.2).</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette vorsichtig bis etwa zur Mittellinie der zeugopodialen Skelettelemente zurück und legen Sie die darunter liegenden Gliedmaßengewebe (Muskeln, Knochen usw.) frei. (Abbildung 1.3). Achten Sie darauf, die Haut nicht zu beschädigen. Siehe Hinweis nach Schritt 2.8.</li>
	<li>Amputieren Sie das freigelegte darunter liegende Gliedmaßengewebe an der Mittellinie des Zeugopoden mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 1.4).</li>
	<li>Drücken Sie das Muskelgewebe mit der chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Dies ist notwendig, um eine verbesserte Heilung zu gewährleisten und auch den Erfolg der Operation zu erhöhen, da hervorstehender Knochen gegen den vernähten Lappen gezackt werden kann und später die Integrität eines intakten Hautlappens stört.</li>
	<li>Ziehen Sie mit der Pinzette vorsichtig die Haut mit voller Dicke über die Amputationsebene, um das freiliegende darunter liegende Gewebe und die Nähte an Ort und Stelle zu bedecken, indem Sie sie mit der ventralen Haut in voller Dicke verbinden (Abbildung 1.5).</li>
	<li>Nähen Sie die verbleibende rechte und linke Seite der Haut in die darunter liegenden ventralen Teile der intakten Haut. Dies kann erreicht werden, indem entweder die Seiten der Klappe "kreuz und quer" genäht werden (empfohlen) (Abbildung 1.6-1.9) oder einfach direkt in die Bauchhaut eingenäht wird. Verwenden Sie die Pinzette und die gebogene Federschere zum Nähen. Stellen Sie sicher, dass keine exponierten darunter liegenden Gewebe zu sehen sind und dass die Nähte fest gebunden sind (mindestens dreimal geknotet). HINWEIS: Es ist wichtig, dass die intakte Haut in den Schritten 2.4, 2.7-2.8 nicht beschädigt wird. Wir haben festgestellt, dass Schäden an der Haut in voller Dicke mit erfolglosen Operationen korreliert sind, da die Schadensbereiche immer noch eine kleine Wundepidermis bilden können. Wenn möglich, versuchen Sie, eine stumpfere Pinzette zu verwenden, wenn Sie die Hautklappe in voller Dicke handhaben.</li>
	<li>Führen Sie eine Amputation an der kontralateralen Extremität durch (optionale interne Tierkontrolle), indem Sie sie auf mittlerer Zeugopodenebene mit einer chirurgischen Schere amputieren. Drücken Sie das Muskelgewebe mit einer chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Eine interne kontralaterale Gliedmaßenkontrolle kann durchgeführt werden, um den Erfolg der Operation während Schritt 4 am selben Tier besser beurteilen zu können. Die Amputation desselben Gliedmaßes bei einem separaten Tier kann jedoch auch als Kontrolle dienen.</li>
</ol>3. Postoperative Genesung und Pflege
<ol><li>Sobald die Operation abgeschlossen ist, legen Sie ein Kimwipe oder ein steriles Papiertuch auf den Boden des Behälters oder der Petrischale, um es zu benetzen. Legen Sie das Tier in den Behälter auf nassem Eis und wickeln Sie die freiliegenden Enden des Kimwipe- oder Papiertuchs vorsichtig um die Oberseite des Tieres, um es mit Sulfamerazinlösung gut hydratisiert zu halten. Lassen Sie es 30 Minuten bis 1 Stunde auf nassem Eis stehen, um eine minimale Bewegung während der Erholung von der Narkose zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen statischen Haltungsbehälter mit 0,5% Sulfamerazinlösung. Axolotls müssen in dieser Lösung für die ersten 24 Stunden bleiben, um eine Infektion zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie den Axolotl in normales Systemwasser und überwachen Sie die Gesundheit täglich. Stellen Sie sicher, dass jeden Tag keine Nähte herausfallen, da dies dazu führen kann, dass sich eine kleine Wundepidermis bildet, die die Ergebnisse verwirren wird. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gehäusebehälter ausreichend Platz für die Bewegung des Axolotls bietet, und minimieren Sie die Wahrscheinlichkeit, dass die vernähte Extremität am Axolotl mit den Seiten des Behälters in Berührung kommt. Dies wird dazu beitragen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation.</li>
</ol>4. Beurteilung des Operationserfolgs unter dem Stereomikroskop
HINWEIS: Wir empfehlen, die Tiere mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop zu untersuchen, um die Integrität des gesamten Hautlappens und den Erfolg der Operation zu beurteilen.
<ol><li>Betäuben Sie den Axolotl in 0,1% Tricain wie in Schritt 2.1. Stellen Sie sicher, dass im Behälter ausreichend Platz ist, damit sich der Axolotl bewegen kann.</li>
	<li>Wenn Sie in den ersten zwei Wochen nach der Operation inspizieren, untersuchen Sie die vernähte Extremität mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine Nähte herausgekommen sind und dass eine klare dünne Wundepidermis nirgendwo sichtbar ist. Wenn Sie in der dritten Woche nach der Operation oder später inspizieren, stellen Sie sicher, dass sich kein Blastema gebildet hat, und vergleichen Sie mit dem Verlauf der normalen amputierten Kontrollextremität (entweder von demselben Tier oder einem anderen Tier) während der Regeneration (dh ob sich ein Blastema gebildet hat).</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, bringen Sie den Axolotl auf normale Systemwasser- und Haltungsbedingungen zurück.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung von Operationen mit vollem Hautlappen in Axolotl-Gliedmaßen, um die Bildung von Wundepidermis zu hemmen. Während diese Operation im Vergleich zu anderen Methoden zur Hemmung der Wundepidermisbildung relativ einfach und technisch reproduzierbar ist, gibt es mehrere kritische Schritte, die den Erfolg der Operation beeinflussen können. Erstens, wenn Sie den intakten vollen Hautlappen über das freiliegende darunter liegende Gewebe ziehen, ist es von größter Bedeutung, dass die Haut in voller Dicke in keiner Weise beschädigt wird. Eine Schädigung des Hautlappens kann immer noch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen, die zu einem kleinen blastemartigen Auswuchs führen kann. Zweitens, stellen Sie sicher, dass während der postoperativen Versorgung keine Nähte ausfallen, da dies auch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen kann. Bis zu diesem Punkt ist es wichtig, den potenziellen Kontakt zwischen der vernähten Extremität und allen Oberflächen zu minimieren, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation. Mehrere Möglichkeiten, dies zu verhindern, bestehen darin, den Axolotl in einem ausreichend großen Behälter unterzubringen und zu betäuben, so dass der Axolotl nach der Operation viel Platz hat, um sich zu bewegen.
Diese Operation hat auch mehrere Einschränkungen. Am bemerkenswertesten ist vielleicht, dass der Erfolg von Operationen nur auf zwei Arten beurteilt werden kann: mit dem Sezierbereich während der ersten zwei Wochen der Operation, um nach dem Fehlen einer Wundepidermis zu suchen und / oder zu überprüfen, ob sich innerhalb von 3 Wochen ein Blastema bildet. Während diese Methoden effektiv sind, haben sie einen relativ geringen Durchsatz. Die Entwicklung zukünftiger transgener Reporter-Axolotls für Wundepidermis-spezifische Marker kann zu einem schnelleren Screening auf erfolgreiche und erfolglose Operationen beitragen. Darüber hinaus ist diese Operation bei jüngeren Tieren schwieriger durchzuführen, da die intakte Haut zerbrechlicher ist. Die Verwendung von subadulten oder adulten Axolotls wird daher empfohlen.
Während diese Operation ursprünglich in N. viridiscens19 entwickelt wurde, wurde sie leicht für Axolotls25,39 angepasst und kann wahrscheinlich auch auf andere Salamanderarten angewendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung dieser Technik auf zukünftige regenerative Studien zu Gliedmaßen die Forscher in die Lage versetzen wird, sowohl mehr Werkzeuge zur Behandlung der Wundepidermisbiologie zu entwickeln als auch die zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren, die ihre Funktion bei der Einleitung der Blastomabildung antreiben.

Seit Lazzaro Spallanzani es 17681 gemeldet hat, ist die Regeneration der Salamandergliedmaßen eines der am besten untersuchten natürlichen regenerativen Phänomene, das Biologen seit Jahrhunderten verliebt. Eine erfolgreiche Regeneration der Gliedmaßen hängt von der Bildung, dem Auswachsen und der anschließenden Musterung einer undifferenzierten Zellstruktur ab, die als Blastema bekannt ist. Forscher haben bedeutende Fortschritte beim Verständnis der zellulären Zusammensetzung des Blastomas gemacht und welche unterstützenden Gewebe und Zelltypen für seine Bildung notwendig sind2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Die koordinierten Signalmechanismen zwischen verschiedenen Geweben und Zelltypen, die zur Initiierung der Blastembildung führen, sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.
Eine Schlüsselvoraussetzung für eine erfolgreiche Blastomenbildung und Regeneration ist die Wundepidermis, ein vorübergehendes und spezialisiertes Epithel, das die Amputationsebene innerhalb von 12 Stunden nach der Amputation abdeckt10. Nach der Amputation wandern Epithelzellen von der intakten Haut proximal zur Verletzung schnell über die Amputationsebene und bilden ein dünnes Wundepithel14. Wenn sich das Blastema in den folgenden Wochen bildet, entwickelt sich die frühe Wundepidermis zu einer dickeren epithelialen Signalstruktur, der apikalen Epithelkappe (AEC)15. Während normale Haut in voller Dicke sowohl eine Epithel- als auch eine Hautschicht enthält, die durch eine Basallamina getrennt sind, besteht die Wundepidermis/AEC nur aus einer Epithelschicht und es fehlt eine Basallamina16,17. Das Fehlen der Basallamina und der Dermis ermöglicht einen direkten Kontakt zwischen den Wundepithelzellen und den darunter liegenden Geweben, was eine bidirektionale Signalübertragung zwischen den beiden Kompartimenten erleichtert, die sowohl für die Blastembildung als auch für die Aufrechterhaltung von Blastemen entscheidend ist17,18.
Klassische experimentelle Studien entwickelten verschiedene innovative chirurgische Methoden, um die Funktion und Notwendigkeit der Wundepidermis / AEC durch Hemmung ihrer Bildung zu untersuchen. Diese Methoden umfassten das Nähen19 oder das Pfropfen der Haut in voller Dicke20,21 über die Amputationsebene, das sofortige Einnähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle22 und die kontinuierliche tägliche Entfernung oder Bestrahlung der frühen Wundepidermis und AEC23,24. Insgesamt stellten diese Experimente nicht nur die Bedeutung der Wundepidermis/AEC fest, sondern bestimmten auch ihre Rolle bei der frühen Gewebehistolyse sowie bei der Aufrechterhaltung der Progenzellproliferation und des blastemalen Auswachsens13 während der gesamten Regeneration.
Diese früheren Studien beschränkten sich jedoch weitgehend auf histologische Färbungen sowie tritiierte Thymidinimpulse, um die Zellproliferation zu verfolgen. Tatsächlich wurde die Überprüfung dieser klassischen Experimente mit modernen Sequenzierungstechnologien und Funktionstechniken bei Salamandern erst kürzlich durchgeführt und hat zur Entdeckung zusätzlicher Rollen für die Wundepidermis bei der Modulation von Entzündungen und ECM-Abbau / -Ablagerung in frühen Stadien der Regeneration geführt25. Mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenom- und Transkriptomsequenzen26,27,28,29,30,31,32,33,34, sowie der wachsenden Anzahl von funktionellen Methoden, die in Salamanderarten verfügbar sind11,35,36,37,38 sind die Forscher nun gut positioniert, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Bildung, Funktion und AEC-Entwicklung der Wundepidermis antreiben.
Leider sind einige dieser klassischen Methoden, die zur Hemmung der Wundepidermisbildung verwendet werden, technisch anspruchsvoll und stellen im selben Experiment Schwierigkeiten für die Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten dar. Zum Beispiel kann die Aufrechterhaltung von Hauttransplantaten eine Herausforderung sein, da Transplantate schließlich von der Wirtsextremität fallen können und die Entfernung der Wundepidermis / AEC täglich schwierig ist, ohne das darunter liegende Gewebe zu schädigen. Darüber hinaus ist das Nähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle eine Herausforderung und erfordert zusätzliche Verletzungen an der Insertionsstelle. Auf der anderen Seite ist das Nähen von Haut in voller Dicke unmittelbar über der Amputationsebene relativ einfach, technisch reproduzierbar und führt zu minimalen Gewebeschäden. Diese Vollhautlappen-Operationsmethode (FSF) wurde bereits 1976 von Anthony Mescher bei erwachsenen Molchen (Notophthalmus viridiscens) entwickelt. Er zeigte, dass die FSF-Operation die Bildung und Funktion der Wundepidermis hemmte, indem sie sowohl die Migration von Epithelzellen über die Amputationsebene als auch den direkten Kontakt zwischen Epithelzellen und den darunter liegenden Geweben verbot.
Hier wird dieser chirurgische Eingriff Schritt für Schritt mit dem Axolotlglied gezeigt. In Verbindung mit modernen Molekular- und Sequenzierungstechnologien kann sich diese Technik für Forscher als sehr hilfreich erweisen, um unser Verständnis der Bildung und Funktion von Wundepidermis / AEC während der Regeneration der Gliedmaßen zu vertiefen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassische Experimente in der regenerativen Biologie des Salamanders im letzten Jahrhundert haben seit langem gezeigt, dass die Wundepidermis eine entscheidende Signalstruktur ist, die sich nach der Amputation schnell bildet und für die Regeneration der Gliedmaßen erforderlich ist. Die Methoden zur Untersuchung seiner genauen Funktion auf molekularer Ebene in den letzten Jahrzehnten waren jedoch aufgrund eines Mangels an präzisen funktionellen Techniken und genomischen Informationen, die in Salamander-Modellsystemen verfügbar sind, begrenzt. Aufregenderweise ermöglicht es die jüngste Fülle von Sequenzierungstechnologien, gepaart mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenome und dem Aufkommen funktioneller genetischer Testmethoden, einschließlich CRISPR, diese grundlegenden Experimente mit beispielloser molekularer Auflösung erneut zu besuchen. Hier beschreibe ich, wie man die klassisch entwickelte Vollhautlappenoperation (FSF) bei erwachsenen Axolotls durchführt, um die Bildung der Wundepidermis unmittelbar nach der Amputation zu hemmen. Die Wundepidermis bildet sich normalerweise durch distale Migration von Epithelzellen in der Haut proximal zur Amputationsebene, um die Wunde von der äußeren Umgebung abzudichten. Die Operation beinhaltet das sofortige Nähen der Haut in voller Dicke (die sowohl epidermale als auch dermale Schichten umfasst) über der Amputationsebene, um die Migration von Epithelzellen und den Kontakt mit dem darunter liegenden beschädigten mesenchymalen Gewebe zu behindern. Erfolgreiche Operationen führen zur Hemmung der Blastembildung und der Regeneration der Gliedmaßen. Durch die Kombination dieser chirurgischen Methode mit zeitgenössischen nachgelagerten molekularen und funktionellen Analysen können Forscher beginnen, die molekularen Grundlagen der Funktion und Biologie der Wundepidermis während der Regeneration der Gliedmaßen aufzudecken.

Dieses chirurgische Protokoll ermöglicht die vollständige Hemmung der Wundepidermisbildung (Abbildung 1) und letztendlich die Regeneration der Gliedmaßen. Eine erfolgreiche Operation führt in etwa 2-3 Wochen zu keiner Blastembildung, abhängig von der Größe des Tieres, während Kontrollregenerationsgliedmaßen normalerweise ein Blastema bilden sollten.
Forscher sollten das vernähte Glied alle 2-3 Tage mit bloßem Auge untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte nicht herausgesprungen sind und sich kein Blastema bildet. Wenn eine oder mehrere der Nähte herausspringen, kann sich immer noch eine Wundepidermis bilden, die entweder zu einem kleinen oder großen Blastema und einer erfolglosen Operation führt (Abbildung 2). Darüber hinaus sollten Forscher die vernähte Extremität mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass eine dünne Wundepidermis nirgendwo auf der Amputationsoberfläche sichtbar ist. Zum Vergleich sollten die Forscher auch die regenerierende Extremität untersuchen, die eine Wundepidermis über der Amputationsebene haben und über 2-3 Wochen ein Blastema bilden sollte. Die Wundepidermis erscheint dünn und klar, während die normale Haut bei Leuzismus-, Albino- oder Wildtyp-Axolotlen undurchsichtiger und blassrosa (fast weiß), hellgelb oder dunkelgrün erscheint.
Wenn Forscher Gewebe vor den Blastomenbildungsstadien nach 2-3 Wochen sammeln möchten, sollten sie die vernähten Gliedmaßen vor der Probenentnahme untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben und sich keine kleine Wundepidermis bildet. Darüber hinaus können durch eine sagitale Schnittung durch das vernähte Gliedmaßengewebe und die Durchführung histologischer Analysen zu einem beliebigen Zeitpunkt auch das Vorhandensein der Dermis aus dem gesamten Hautlappen, der die gesamte Amputationsebene umgibt, und das Fehlen einer Wundepidermis überprüft werden (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte der vollständigen Hautlappenoperation. Die Schritte des Protokolls sind hier nummeriert und dargestellt. Die gepunkteten Linien bezeichnen die Amputationsebenen in den Schritten 1 und 3 des Protokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Operationen mit vollem Hautlappen. Repräsentatives Hellfeldbild einer Gliedmaße, die 25 Tage nach der Amputation (dpa) einer erfolgreichen Operation (links), einer erfolglosen Operation (rechts) und einer Kontrollregenerationsextremität (keine Operation) unterzogen wurde. Die erfolgreiche Operation hat eine flache Amputationsebene, auf der der volle Hautlappen vernäht wurde, während sich bei der erfolglosen Operation ein kleines Blastema entwickelt. Pfeilspitzen bezeichnen die Amputationsebene und weiß gepunktete Linien dienen dazu, das Fehlen eines Blastems bei der erfolgreichen Operation und das Vorhandensein von Blastemen bei der erfolglosen Operation zu visualisieren und die regenerierenden Gliedmaßen zu kontrollieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Abbildung 3: Histologische Färbung normaler regenerierender und FSF-vernähter Gliedmaßen. (A-B') Repräsentative Hellfeldbilder von picro-mallory gefärbten Schnitten aus regenerierenden (A-A') und vernähten Axolotlgliedmaßen (B-B') bei 7 dpa. Einsätze in A und B werden in A' bzw. B' dargestellt. Die kollagenschwere Hautschicht kleidet und bedeckt die gesamte Amputationsebene in vernähten Gliedmaßen. Die Amputationsebene wird in A-B durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstabsstäbe repräsentieren 500 μm. Diese Figur wurde von Tsai et al.25 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Aufrufe.  Harvard University. Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Serie: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Forschung

Biologie

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Optimierung des NIRS zur Beurteilung der Gefäßfunktion der unteren Gliedmaßen

Near-Infrared Spectroscopy During Reactive Hyperemia for the Assessment of Lower Limb Vascular Function 

Vascular diseases of the lower limb contribute substantially to the&#160;global burden of cardiovascular disease and comorbidities such as diabetes. Importantly, microvascular dysfunction can occur prior to, or alongside, macrovascular pathology, and both potentially contribute to patient symptoms and disease burden. Here, we describe a non-invasive approach using near-infrared spectroscopy (NIRS) during reactive hyperemia, which provides a standardized assessment of lower limb vascular (dys)function and a potential method to evaluate the efficacy of therapeutic interventions. Unlike alternative methods, such as contrast-enhanced ultrasound, this approach does not require venous access or sophisticated image analysis, and it is inexpensive and less operator-dependent. This description of the NIRS method includes representative results and standard terminology alongside the discussion of measurement considerations, limitations, and alternative methods. Future application of this work will improve standardization of vascular research design, data collection procedures, and harmonized reporting, thereby enhancing translational research outcomes in the areas of lower limb vascular (dys)function, disease, and treatment.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Gefäßfunktion und körperlichen Leistungsfähigkeit bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen durch neuartige Interventionen und NIRS-Te

Here, we describe a non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia in the lower limb. This protocol provides a standardized assessment of vascular and microvascular responsiveness that may be used to determine the presence of vascular dysfunction as well as the efficacy of therapeutic interventions.

Nahinfrarotspektroskopie bei reaktiver Hyperämie zur Beurteilung der Gefäßfunktion der unteren Extremitäten 

Vascular diseases of the lower limb contribute substantially to the&#160;global burden of cardiovascular disease and comorbidities such as diabetes. ...