Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

著者は、ダグの絶え間ない励ましと揺るぎないサポート、そして原稿に関する有益なフィードバックとコメントをくれたメルトン研究所のメンバーに感謝します。著者はまた、ハーバード大学動物資源局(OAR)の献身的な動物ケアに感謝したいと思います。

すべての動物実験は、ハーバード大学のIACUC(プロトコル#:11-32)およびAAALACガイドラインに従って実施した。
1. 麻酔と回復のための解決策とセットアップの準備
<ol><li>麻酔のための新鮮な0.1%トリカイン溶液および回収のための0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製する。関連する研究機関で承認されたIACUCプロトコルに従って、水を使用してアキソロトル飼育に適した溶液37 を作ります(例えば、ホルトフレターのソリューションを修正しました)。溶液がよく混合され、アクソロトル全体を沈めるのに十分な量が準備されていることを確認してください。<ol>
<li>0.1%トリカイン溶液を調製するには、1gのトリカインおよび1gの炭酸水素ナトリウムを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。</li>
		<li>0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製するには、スルファメラジンナトリウム塩5gを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。スルファメラジン溶液は、外科的回復中の細菌感染を防止する抗生物質である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clidox-Sまたは70%エタノールで噴霧して手術領域を消毒する。手術器具(鉗子、解剖はさみ、スプリングはさみ)をオートクレーブで滅菌します。複数回の手術を行う場合は、動物同士の熱いビーズ滅菌器で手術器具を滅菌してください。</li>
	<li>回収エリアを設定するには、15cmのペトリ皿またはアクソロトルに収まる容器を、湿った氷で満たされたバケツの上に置きます。ペトリ皿に低レベルの0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を充填し、アキソロトルが完全に水没しないようにする。手術後の氷上での回復は、麻酔から目覚めている間、動物の動きを遅らせ、縫合された領域を比較的邪魔されずに治癒することを可能にする。 注:この設定は、研究者が利用可能な材料に応じてカスタマイズできます。</li>
</ol>2.フルスキンフラップ手術を行う
<ol><li>アキソロトルを0.1%トリカイン溶液の容器に浸すことによって麻酔する。これには約15〜20分かかります。尾のピンチを行うことによって、軸索が実際に完全に麻酔されていることを確認してください。軸索からの応答がない場合は、手術を続行します. 注:この手術には、古くて大きなアキソロトル(少なくとも15cmのサイズ)を使用してください。プラスチックピペットを使用してアキソロトル系水で定期的に皮膚を濡らすことにより、手術中、アキソロトルが十分に水分補給されたままであることを確認してください。手術前に滅菌PBSでその領域を灌漑することによって、手術部位を無菌的に準備するようにしてください。動物はまた、処置のために滅菌外科用ドレープの上に置かれるべきである。</li>
	<li>解剖はさみを用いて、ゼウゴポディアル骨格要素の遠位端で四肢切断を行う(図1.1)。</li>
	<li>スプリングハサミを使用して、皮膚の腹部に小さな切開(約2mm)を行います(図1.2)。</li>
	<li>鉗子を使用して、皮膚をゼウゴポディアル骨格要素のほぼ正中線まで慎重に剥がし、基礎となる四肢組織(筋肉、骨など)を露出させる。(図 1.3)。皮膚を傷つけないようにしてください。ステップ 2.8 の後の注を参照してください。</li>
	<li>外科用はさみを使用して、ゼウゴポッドの正中線で露出した下肢組織を切断する(図1.4)。</li>
	<li>外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。 注:これは、治癒の改善を確実にし、突き出た骨が縫合されたフラップに対してギザギザになり、後で無傷の皮膚フラップの完全性を混乱させる可能性があるため、手術の成功を高めるためにも必要です。</li>
	<li>鉗子を使用して、余分な全厚皮膚を切断面上に慎重に引っ張り、露出した下層組織を覆い、腹側全厚皮膚と接続して縫合糸を所定の位置に収めます(図1.5)。</li>
	<li>皮膚フラップの残りの左右を無傷の皮膚の腹側部分に縫合する。これは、フラップの側面を「十字」の方法で縫合するか(推奨)(図1.6-1.9)、または単に腹側皮膚にまっすぐに縫合することによって行うことができます。縫合には鉗子と湾曲したスプリングハサミを使用してください。露出した下層の組織が見えず、縫合糸がしっかりと結ばれていることを確認してください(少なくとも3回結び目があります)。 注:手順2.4、2.7-2.8で無傷の皮膚が損傷していないことが重要です。我々は、全厚皮膚への損傷が、損傷領域がまだ小さな創傷表皮を形成する可能性があるため、失敗した手術と相関していることを見出した。可能であれば、全厚の皮膚フラップを手渡すときは、鈍い一対の鉗子を使用してみてください。</li>
	<li>外科用はさみで中顎動物レベルで切断することにより、対側肢の切断(オプションの内部動物制御)を行う。外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。 注:同じ動物におけるステップ4中の手術の成功をよりよく評価するために、内部対側肢制御を行うことができます。しかしながら、別の動物における同じ四肢の切断もまた、対照として役立つために使用され得る。</li>
</ol>3. 術後の回復とケア
<ol><li>手術が完了したら、キムワイプまたは滅菌ペーパータオルを容器またはペトリ皿の底に置き、濡らします。動物をぬるま湯の上の容器に入れ、キムワイプまたはペーパータオルの露出した端を動物の上の周りに静かに包み込み、スルファメラジン溶液で十分に水分補給してください。麻酔からの回復中に最小限の動きを確実にするために、30分から1時間湿った氷の上に放置する。</li>
	<li>動物を0.5%スルファメラジン溶液で静的な収容容器に入れる。Axolotlsは、感染を防ぐために最初の24時間この溶液に留まらなければなりません。</li>
	<li>アキソロトルを通常のシステム水に入れ、毎日健康状態を監視します。縫合糸が毎日落ちないように注意してください、これは結果を混乱させる小さな創傷表皮の形成をもたらす可能性があるので。 注:ハウジング容器に、アクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認し、アクソロトルの縫合肢が容器の側面に接触する可能性を最小限に抑えてください。これは、縫合糸が所定の位置にとどまることを確実にするのに役立ちます, 特に手術後の最初の週に.</li>
</ol>4. 実体顕微鏡による手術の成功評価
注:少なくとも週に1回は実体顕微鏡で動物をチェックし、皮膚全体のフラップの完全性と手術の成功を評価することをお勧めします。
<ol><li>ステップ2.1のように0.1%トリカインでアキソロトルを麻酔する。容器にアクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認してください。</li>
	<li>術後最初の2週間に検査する場合は、実体顕微鏡を使用して縫合された四肢を検査し、縫合糸が飛び出していないこと、および透明な薄い創傷表皮がどこにも見えないことを確認します。術後3週目以降に検査する場合は、芽球腫が形成されていないことを確認し、正常な対照切断された四肢(同じ動物または別の動物のいずれかから)が再生中にどのように進行したか(すなわち、芽球腫が形成されたかどうか)と比較する。</li>
	<li>完了したら、アキソロトルを通常のシステムの水と飼育条件に戻します。</li>
</ol>

<ol>
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著者らは開示するものは何もありません。

この記事では、創傷表皮形成を阻害するために軸索四肢において皮膚全皮フラップ手術を行うためのプロトコルについて説明する。この手術は、創傷表皮形成を阻害する他の方法と比較して比較的簡単で技術的に再現可能であるが、手術の成功に影響を与える可能性のあるいくつかの重要なステップがある。まず、露出した下層組織の上に無傷のフルスキンフラップを引っ張るとき、フルスキンがいかなる方法でも損傷を受けないことが最も重要である。皮膚フラップの損傷は依然として小さな創傷表皮の形成をもたらし、これは小さな芽球腫様の伸長をもたらし得る。第二に、術後ケア中に縫合糸が抜けないようにし、小さな創傷表皮の形成にもつながり得る。この点まで、縫合された四肢と任意の表面との間の潜在的な接触を最小限に抑えることは、特に手術後の最初の週に重要である。これを防ぐいくつかの方法は、アキソロトルが手術後に動き回るのに十分なスペースがあるように、十分に大きな容器にアキソロトルを収容し、麻酔をかけることを伴う。
この手術にはいくつかの制限もあります。おそらく最も注目すべきは、手術の成功は2つの方法でしか評価できないということです:手術の最初の2週間に解剖範囲を使用して創傷表皮の不在を検索すること、および/または3週間以内に芽球腫が形成されるかどうかをチェックする。これらの方法は効果的ですが、スループットは比較的低くなります。創傷表皮特異的マーカーのための将来のトランスジェニックレポーターaxolotlsの開発は、成功した手術と失敗した手術のより迅速なスクリーニングに役立つ可能性がある。さらに、この手術は、無傷の皮膚がより壊れやすいため、若い動物に行うことがより困難です。したがって、亜成体または成人の軸索を使用することが推奨される。
この手術はもともとN. viridiscens19で開発されましたが、axolotls25,39に容易に適応されており、他のサンショウウオ種にも適用できる可能性があります。要約すると、この技術を将来の四肢再生研究に適用することで、研究者は創傷表皮生物学に対処するためのより多くのツールを開発し、芽球腫形成を開始する際にその機能を駆動する根底にあるメカニズムを特定することができます。

Lazzaro Spallanzaniが17681年に報告して以来、サンショウウオの四肢再生は、何世紀にもわたって生物学者を魅了してきた最もよく研究された自然再生現象の1つです。四肢の再生の成功は、芽球腫として知られる未分化の細胞構造の形成、伸長、およびその後のパターン化にかかっています。研究者らは、芽球腫の細胞組成と、その形成にどの支持組織および細胞型が必要であるかを理解する上で大きな進歩を遂げました2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .しかし、芽球腫形成の開始につながる異なる組織および細胞型間の協調シグナル伝達機構は、ほとんど理解されていないままである。
芽球腫の形成と再生を成功させるための重要な要件は、切断後12時間以内に切断面を覆う一過性の特殊な上皮である創傷表皮です10。切断に続いて、損傷に近位にある無傷の皮膚から上皮細胞は、切断面上を急速に移動し、薄い創傷上皮14を形成する。次の数週間で芽球腫が形成されると、初期の創傷表皮は、頂端上皮キャップ(AEC)と呼ばれるより厚い上皮シグナル伝達構造に発達する15。通常の全厚皮膚は基底薄層によって分離された上皮層と真皮層の両方を含むが、創傷表皮/ AECは上皮層のみからなり、基底薄層を欠いている16,17。基底薄層および真皮の不在は、創傷上皮細胞と下層組織との間の直接接触を可能にし、これは、芽球腫形成および維持の両方にとって重要である2つの区画間の双方向シグナル伝達を促進する17,18。
古典的な実験的研究は、創傷表皮/AECの機能およびその形成を阻害することによって必要性を探るために、様々な革新的な外科的方法を考案した。これらの方法には、縫合19または切断面上の全厚皮膚20,21の移植、切断された四肢の体腔内への即時縫合22、および早期創傷表皮およびAEC23,24の毎日の連続的な除去または照射が含まれていた。全体として、これらの実験は創傷表皮/AECの重要性を確立しただけでなく、再生中は前駆細胞増殖と芽球外生を維持するだけでなく、初期の組織組織溶解におけるその役割をさらに決定しました13。
しかし、これらの以前の研究は、組織学的染色および細胞増殖を追跡するためのトリチウム化チミジンパルスに大きく制限されていた。実際、サンショウウオにおける現代のシーケンシング技術と機能的技術を用いてこれらの古典的な実験を再考することはごく最近になって行われ、再生の初期段階における炎症およびECM分解/沈着を調節する上で創傷表皮に対するさらなる役割の発見につながった25。様々なサンショウウオゲノムおよびトランスクリプトーム配列26,27,28,29,30,31,32,33,34の放出、ならびにサンショウウオ種で利用可能な機能的方法の急増により11,35,36,37,38研究者らは現在、創傷表皮の形成、機能、およびAEC発生を駆動する分子メカニズムを解明し始めるのに有利な立場にある。
残念なことに、創傷表皮形成を阻害するために使用されるこれらの古典的な方法のいくつかは技術的に困難であり、同じ実験における生物学的複製間の再現性に困難を提示する。例えば、移植片が最終的に宿主の四肢から脱落する可能性があり、創傷表皮/ AECの毎日の除去は、基礎となる組織を損傷することなく困難であるため、皮膚移植片を維持することは困難な場合がある。さらに、切断された四肢を体腔内に縫合することは困難であり、挿入部位で追加の傷害も必要とする。一方、切断面のすぐ上に全厚の皮膚を縫合することは比較的簡単で、技術的に再現性があり、組織損傷を最小限に抑えます。このフルスキンフラップ(FSF)外科的方法は、1976年にアンソニー・メッシャーによって成体のイモリ(Notophthalmus viridiscens)で以前に開発されました。彼は、FSF手術が切断面上での上皮細胞移動と上皮細胞と下層組織との間の直接接触の両方を禁止することによって、創傷表皮の形成および機能を阻害することを実証した。
ここでは、この外科的処置を、軸索四肢を用いて段階的に示している。現代の分子およびシーケンシング技術と組み合わせることで、この技術は、研究者が創傷表皮/ AECの形成および四肢再生中の機能についての理解を深めるために非常に有用であることが証明されるかもしれない。

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

前世紀にわたるサンショウウオ再生生物学における古典的な実験は、創傷表皮が切断後に急速に形成され、四肢再生に必要とされる重要なシグナル伝達構造であることを長い間確立してきた。しかし、過去数十年にわたり、その正確な機能を分子レベルで研究する方法は、サンショウウオモデルシステムで利用可能な正確な機能技術とゲノム情報の不足のために制限されてきた。近年のシーケンシング技術の多さと、さまざまなサンショウウオゲノムの公開、CRISPRを含む機能的遺伝子検査法の出現により、これらの基礎実験を前例のない分子分解能で再考することが可能になりました。ここでは、切断直後の創傷表皮形成を阻害するために、古典的に開発されたフルスキンフラップ(FSF)手術を成人の軸索軟体において行う方法について説明する。創傷表皮は、通常、切断面に近い皮膚における上皮細胞の遠位移動を介して形成され、創傷を外部環境から遮断する。手術では、切断面上に全厚の皮膚(表皮層と真皮層の両方を含む)を直ちに縫合して、上皮細胞の遊走および根底にある損傷した間葉系組織との接触を妨げる。手術が成功すると、芽球腫形成および四肢再生の阻害が生じる。この手術方法を現代の下流の分子および機能分析と組み合わせることにより、研究者は四肢再生中の創傷表皮機能および生物学の分子基盤を明らかにし始めることができる。

この外科的プロトコールは、創傷表皮形成の完全な阻害(図1)を可能にし、最終的には四肢再生を可能にする。手術が成功すると、動物の大きさに応じて約2〜3週間で芽球腫の形成は生じませんが、コントロール再生肢は正常に芽球腫を形成するはずです。
研究者は、縫合された四肢を肉眼で2〜3日ごとに検査して、縫合糸が飛び出していないこと、および芽球腫が形成されていないことを確認する必要があります。縫合糸の1つ以上が飛び出しても、創傷表皮が依然として形成され、その結果、小または大きな芽球腫が発生し、手術が失敗する可能性があります(図2)。さらに、研究者は、切断表面のどこにも薄い創傷表皮が明らかでないことを確認するために、実体顕微鏡下で少なくとも毎週1回縫合された四肢を検査すべきである。比較のために、研究者らはまた、切断面上に創傷表皮を有し、2〜3週間にわたって芽球腫を形成するはずの再生四肢の対照を調べるべきである。創傷表皮は薄くて透明に見えるが、正常な皮膚は、白血病性、アルビノ性、または野生型のアクソロトルにおいて、それぞれより不透明で淡いピンク色(ほぼ白色)、淡黄色、または濃い緑色に見える。
研究者が2〜3週間で芽球腫形成段階の前に組織を採取したい場合は、サンプル採取前に縫合された四肢を検査して、縫合糸が所定の位置に留まり、小さな創傷表皮が形成されていないことを確認する必要があります。さらに、縫合された四肢組織を矢状に切片化し、任意の時点で組織学的解析を行うことで、切断面全体を囲む皮膚全部フラップからの真皮の存在および創傷表皮の不在を確認することもできる(図3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> 図1:フルスキンフラップ手術のステップの概略図。 プロトコルの手順には番号が付けられ、図解されています。点線は、プロトコルのステップ1および3における切断の平面を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> 図2:フルスキンフラップ手術の成功例と失敗例 切断後25日目(dpa)における手術成功(左)、手術不成功(右)、および対照再生肢(手術なし)を受けた四肢の代表的な明視野画像。成功した手術は、完全な皮膚フラップが縫合された平らな切断面を有するが、失敗した手術は、小さな芽腫を発症する。矢印は切断面を示し、白い点線は成功した手術における芽球腫の不在と失敗した手術における芽球腫の存在の視覚化を助け、再生肢を制御する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> 図3:正常再生およびFSF縫合四肢の組織学的染色。 (A-B')再生(A−A ́)および縫合された軸索四肢(B−B ́)からのピクロマロリー染色切片の代表的な明視野画像。AおよびBのインセットは、それぞれA'およびB'で示されている。コラーゲンを多く含む真皮層は、縫合された四肢で切断面全体を覆います。切断面はA−Bにおいて矢印で表記される。スケールバーは500μmを表す。この図は蔡ら25から翻案されたものである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

本稿では、切断面上に全厚皮膚を直ちに縫合することにより、軸索四肢再生時の創傷表皮形成を抑制する外科的方法を実行する方法を説明する。この方法により、研究者は四肢再生の初期段階における創傷表皮の機能的役割を調査することができます。

アキソロトル四肢再生中のフルスキンフラップ手術による創傷表皮形成の阻害

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K ビュー.  Harvard University. 本稿では、切断面上に全厚皮膚を直ちに縫合することにより、軸索四肢再生時の創傷表皮形成を抑制する外科的方法を実行する方法を説明する。この方法により、研究者は四肢再生の初期段階における創傷表皮の機能的役割を調査することができます。

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

発生生物学

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

遺伝学

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

胚移植による変異ハプロイド肢を用いたキメラ・アクセロリトの生成

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

マウス切除創傷治癒モデルと組織形態学的創傷解析

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

アピカル切除マウスモデルは、初期の哺乳類の心臓の再生を研究するために

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

医学

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

生物学

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

再生軸切除における微小外科ラミネクトミーによる挫傷脊髄損傷

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

成人 アフリカツメガ エル心臓の頂端切除モデル

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>プレート固定を使用して、ウーパールーパーの骨治癒と四肢再生の研究

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:細胞および分子メカニズム、骨治癒、およびヒト治療への影響に関する洞察を通じて、ウーパールーパーの再生を探求する

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

Ambystoma mexicanumのプレート固定による大腿骨骨切り術の安定化

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...

アキソロトル四肢再生中のフルスキンフラップ手術による創傷表皮形成の阻害

要約

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タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

胚移植による変異ハプロイド肢を用いたキメラ・アクセロリトの生成

マウス切除創傷治癒モデルと組織形態学的創傷解析

アピカル切除マウスモデルは、初期の哺乳類の心臓の再生を研究するために

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

再生軸切除における微小外科ラミネクトミーによる挫傷脊髄損傷

成人アフリカツメガエル心臓の頂端切除モデル

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

Ambystoma mexicanumのプレート固定による大腿骨骨切り術の安定化

アキソロトル四肢再生中のフルスキンフラップ手術による創傷表皮形成の阻害

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タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

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アピカル切除マウスモデルは、初期の哺乳類の心臓の再生を研究するために

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

再生軸切除における微小外科ラミネクトミーによる挫傷脊髄損傷

成人 アフリカツメガ エル心臓の頂端切除モデル

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

Ambystoma mexicanumのプレート固定による大腿骨骨切り術の安定化

成人アフリカツメガエル心臓の頂端切除モデル