Dieses Protokoll verwendet histologische Analysen, um robuste morphometrische Messungen von Mausexzisionalwunden zu erhalten. Mit dieser Technik können wir die gesamte Wunde mit einer Teilmenge von seriellen Abschnitten analysieren, so dass wir Fehler genauer erkennen können, die andernfalls übersehen werden könnten. Demonstriert wird das Verfahren von Lindsey Rhea, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor.
Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex in einer anästhesierten erwachsenen Maus, tragen Salbe auf die Augen des Tieres und verwenden Sie einen elektrischen Rasiermesser Clipper in einer kaudal-rostralen Bewegung, um das Fell auf der Rückseite der Maus auf der Schulterebene zu entfernen. Verwenden Sie eine Rasierklinge in einem 20-Grad-Winkel von hinten in einer rostral-kaudalen Bewegung gehalten, um alle verbleibenden Haare von der exponierten Haut zu entfernen, dann reinigen Sie die Haut mit einem Povidon Jod und einem 70%isopropyl Alkohol Prep Pad Wischen. Für die Wundinduktion ein sauberes Handtuch auf Papierbasis auf eine flache, mit Zahnwachs bedeckte Oberfläche drapieren und die Maus in der anfälligen Position auf das Handtuch positionieren.
Kneifen Sie die Haut der Maus zwischen den Schulterblättern entlang der dorsalen Mittellinie und ziehen Sie die eingeklemmte Hautfalte vom Körper weg. Die Maus in eine seitlich liegende Position schalten, einen Biopsie-Punch der gewünschten Wundgröße so nah wie möglich am Körper platzieren und die Haut entspannen lassen. Drücken Sie den Stempel mit einer Schaukelbewegung, um alle Hautschichten zu durchstechen und entfernen Sie die Schlagbiopsien mit steriler Schere und Pinzette aus der Wunde, um den Schlag bei Bedarf von der umgebenden Haut zu befreien.
Dann lassen Sie die Maus mit Überwachung und Analgesie erholen. Für die morphometrische Analyse des Wundbettes öffnen Sie ein digital esbiertes Wundbild. Um die Skalierungs- und Messeinstellungen festzulegen, wählen Sie unter Analysieren die Option Skalierung festlegen aus, und geben Sie den Abstand in Pixel, die bekannte Entfernung und die Längeneinheit ein.
Wählen Sie Global und OK aus, um die Skalierung für jedes geöffnete Bild gleich zu halten, und wählen Sie Analysieren und Festlegen von Messungen aus, um zu bestätigen, dass das Bereichsfeld aktiviert ist. Um die Wundlänge zu messen, wählen Sie Freihand, und verwenden Sie das Werkzeug, um entlang der dermal-epidermalen Kreuzung zu verfolgen, beginnend mit dem letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, folgen Sie der dermal-epidermalen Kreuzung auf einer Seite der Wunde, wo die wandernde Zunge endet, und folgen Sie weiterhin dem übergeordneten Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf, bis die wandernde Zunge und der erste Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde erreicht sind.
Klicken Sie dann auf Analysieren und Messen. Die Länge der Messung wird in den gleichen Einheiten angezeigt, die in der Skala festgelegt sind. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, messen Sie den Abstand zwischen jeder epidermalen Vorderkante nach dem übergeordneten Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf zum ersten Haarfollikel.
Um den Wundbereich zu messen, verwenden Sie das Freihandwerkzeug, um entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis oder des überlegenen Aspekts des Granulationsgewebes vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite zu verfolgen. Fahren Sie fort, vertikal entlang der Haarfollikel in das Granulationsgewebe zu verfolgen. Sobald der gegenüberliegende Haarfollikel und Fettgewebe oder Muskel erreicht sind, folgen Sie der unteren Grenze des Granulationsgewebes auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde und verbinden Sie den Ausgangspunkt entlang des Haarfollikels, um den Bereich zu schließen.
Wenn die Wunde nicht vollständig epithelialisiert ist, verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis bis zur Vorderkante und kehren Sie zum Ausgangspunkt nach der dermal-epidermalen Kreuzung zurück. Wie dargestellt, konnten wir bei 2D-Messungen in der gesamten Wunde Parameter berechnen, die mit einer 2D-Analyse nur in der Mitte der Wunde nicht möglich waren, was eine häufig verwendete Methode im Feld ist. In diesem Experiment wurden 2D-Messungen der Wundfläche verwendet und über die gesamte Wunde oder eine mittlere Teilmenge der Wunde gemittelt und ergaben keinen signifikanten Unterschied zwischen experimentellen Gruppen oder den Analysemethoden.
Das berechnete Wundvolumen war jedoch zwischen den versuchsreichen Gruppen signifikant unterschiedlich, was die Bedeutung einer tiefgehenden histologischen Analyse der Wundheilungsparameter demonstrierte. Das Generieren von wunden konstant großer Größe für die histologische Analyse und die Durchführung strenger serieller Schnitte sind für eine genaue morphometrische Analyse von entscheidender Bedeutung. Ungefärbte Abschnitte können für Die Immunfluoreszenz oder Massons trichrome Färbung verwendet werden, um andere Aspekte der Wundheilung zu messen, während flashgefrorene Wunden neben der Morphometrie für die quantitative Proteinanalyse verwendet werden können.
