L'autore ringrazia Doug per il suo costante incoraggiamento e supporto incrollabile, così come i membri del laboratorio Melton per i loro utili feedback e commenti sul manoscritto. L'autore desidera anche ringraziare l'Harvard Office of Animal Resources (OAR) per la cura degli animali dedicata.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida IACUC (Protocollo #: 11-32) e AAALAC presso l'Università di Harvard.
1. Preparazione di soluzioni e configurazione per l'anestesia e il recupero
<ol><li>Preparare una soluzione fresca di tricaina allo 0,1% per l'anestesia e una soluzione di sale sodico allo 0,5% di sulfamerazina per il recupero. Rendere le soluzioni con acqua adatta per l'allevamento axolotl37 secondo i protocolli IACUC approvati presso l'istituto di ricerca competente (soluzione di Holtfreter modificata, ad esempio). Assicurarsi che le soluzioni siano ben miscelate e che sia preparato un volume sufficiente per immergere l'intero axolotl.<ol>
<li>Per preparare la soluzione di tricaina allo 0,1%, mescolare 1 g di tricaina e 1 g di bicarbonato di sodio con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta.</li>
		<li>Per preparare la soluzione di sale sodico di sulfamerazina allo 0,5%, mescolare 5 g di sale sodico di sulfamerazina con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta. La soluzione di sulfamerazina è un antibiotico che previene l'infezione batterica durante il recupero chirurgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica spruzzandola con Clidox-S o etanolo al 70%. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze, forbici per sezionare, forbici a molla) mediante autoclave. Se si eseguono più interventi chirurgici, assicurarsi di sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a perline calde tra gli animali.</li>
	<li>Per impostare l'area di recupero, posizionare una capsula di Petri da 15 cm o qualsiasi contenitore che si adatti all'axolotl sopra un secchio pieno di ghiaccio bagnato. Riempire la capsula di Petri con un basso livello di soluzione di sale sodico allo 0,5%, abbastanza tale che l'axolotl non sarebbe completamente sommerso. Il recupero sul ghiaccio post-operatorio rallenterà il movimento dell'animale mentre si risveglia dall'anestesia, consentendo all'area suturata di guarire relativamente indisturbata. NOTA: questa configurazione può essere personalizzata dai ricercatori a seconda dei materiali che hanno a disposizione.</li>
</ol>2. Esecuzione della procedura chirurgica del lembo della pelle completa
<ol><li>Anestetizzare l'axolotl immergendolo in un contenitore di soluzione di tricaina allo 0,1%. Questo richiederà circa 15-20 minuti. Assicurarsi che l'axolotl sia effettivamente completamente anestetizzato eseguendo un pizzico di coda. Se non c'è risposta dall'axolotl, procedere con l'intervento chirurgico. NOTA: Utilizzare axolotl più vecchi e più grandi per questo intervento chirurgico (almeno 15 cm di dimensione). Assicurarsi che l'axolotl rimanga ben idratato durante l'intervento chirurgico bagnando periodicamente la pelle con acqua del sistema axolotl usando una pipetta di plastica. Assicurarsi di preparare asetticamente il sito chirurgico irrigando l'area con PBS sterile prima dell'intervento chirurgico. L'animale deve anche essere posto su un drappo chirurgico sterile per la procedura.</li>
	<li>Eseguire un'amputazione dell'arto all'estremità distale degli elementi scheletrici zeugopodiali utilizzando le forbici di dissezione (Figura 1.1).</li>
	<li>Usando le forbici a molla, fare una piccola incisione (circa 2 mm) sulla porzione ventrale della pelle (Figura 1.2).</li>
	<li>Usando la pinza, staccare con cura la pelle approssimativamente sulla linea mediana degli elementi scheletrici zeugopodiali, esponendo i tessuti degli arti sottostanti (muscoli, ossa, ecc.) (Figura 1.3). Assicurati di non danneggiare la pelle. Vedere la nota dopo il passaggio 2.8.</li>
	<li>Amputare i tessuti degli arti sottostanti esposti sulla linea mediana dello zeugopode usando forbici chirurgiche (Figura 1.4).</li>
	<li>Spingere indietro il tessuto muscolare con le forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto. NOTA: Questo è necessario per garantire una migliore guarigione e anche per aumentare il successo dell'intervento chirurgico in quanto l'osso sporgente può essere frastagliato contro il lembo suturato e interrompere l'integrità di un lembo di pelle intatto in seguito.</li>
	<li>Utilizzando la pinza, tirare con attenzione la pelle extra a tutto spessore sul piano di amputazione per coprire i tessuti sottostanti esposti e suturare in posizione collegandosi con la pelle ventrale a tutto spessore (Figura 1.5).</li>
	<li>Suturare i restanti lati destro e sinistro del lembo della pelle nelle porzioni ventrali sottostanti della pelle intatta. Questo può essere fatto suturando i lati del lembo in modo "incrociato" (consigliato) (Figura 1.6-1.9), o semplicemente suturando direttamente nella pelle ventrale. Utilizzare la pinza e le forbici a molla curve per la sutura. Assicurarsi che non si vedano tessuti sottostanti esposti e che le suture siano legate strettamente (annodate almeno tre volte). NOTA: è fondamentale che la pelle intatta non sia danneggiata nei passaggi 2.4, 2.7-2.8. Abbiamo scoperto che il danno alla pelle a tutto spessore è stato correlato con interventi chirurgici non riusciti, poiché le aree di danno possono ancora formare una piccola ferita epidermide. Se possibile, prova a utilizzare un paio di pinze più opache quando consegni il lembo della pelle a tutto spessore.</li>
	<li>Eseguire un'amputazione sull'arto controlaterale (controllo animale interno opzionale) amputandolo a livello medio zeugopode con forbici chirurgiche. Spingere indietro il tessuto muscolare con forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto. NOTA: Un controllo interno dell'arto controlaterale può essere fatto per valutare meglio il successo dell'intervento chirurgico durante la fase 4 nello stesso animale. Tuttavia, l'amputazione dello stesso arto in un animale separato può anche essere utilizzata per fungere da controllo.</li>
</ol>3. Recupero e cura post-operatoria
<ol><li>Una volta completato l'intervento chirurgico, posizionare un Kimwipe o un tovagliolo di carta sterile sul fondo del contenitore o della capsula di Petri per bagnarlo. Metti l'animale nel contenitore su ghiaccio bagnato e avvolgi delicatamente le estremità esposte del Kimwipe o del tovagliolo di carta intorno alla parte superiore dell'animale per mantenerlo ben idratato con la soluzione di sulfamerazina. Lasciare sul ghiaccio bagnato per 30 minuti a 1 ora per garantire un movimento minimo durante il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Posizionare l'animale in un contenitore statico con soluzione di sulfamerazina allo 0,5%. Gli axolotl devono rimanere in questa soluzione per le prime 24 ore al fine di prevenire l'infezione.</li>
	<li>Posizionare l'axolotl nell'acqua normale del sistema e monitorare quotidianamente la salute. Assicurarsi che nessuna sutura cada ogni giorno in quanto ciò può causare la formazione di una piccola ferita epidermide che confonderà i risultati. NOTA: Assicurarsi che il contenitore dell'alloggiamento disponga di ampio spazio per il movimento dell'axolotl e ridurre al minimo le possibilità che l'arto suturato sull'axolotl possa entrare in contatto con i lati del contenitore. Ciò contribuirà a garantire che le suture rimangano in posizione, specialmente durante la prima settimana dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>4. Valutare il successo dell'intervento chirurgico al microscopio stereoscopico
NOTA: Si consiglia di controllare gli animali al microscopio stereo almeno una volta alla settimana per valutare l'integrità del lembo di pelle completa e il successo dell'intervento chirurgico.
<ol><li>Anestetizzare l'axolotl in 0,1% di tricaina come nel passaggio 2.1. Assicurati che ci sia ampio spazio nel contenitore per far muovere l'axolotl.</li>
	<li>Se si ispeziona durante le prime due settimane dopo l'intervento chirurgico, ispezionare l'arto suturato utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che non siano spuntate suture e che un'epidermide della ferita sottile chiara non sia visibile da nessuna parte. Se si ispeziona la terza settimana dopo l'intervento chirurgico o più tardi, assicurarsi che non si sia formato un blastema e confrontare con il modo in cui il normale arto amputato di controllo (dallo stesso animale o da un animale diverso) è progredito durante la rigenerazione (cioè, se si è formato un blastema).</li>
	<li>Al termine, riportare l'axolotl alle normali condizioni di acqua e allevamento del sistema.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. 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Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici di lembo di pelle intera negli arti axolotl per inibire la formazione dell'epidermide della ferita. Mentre questo intervento chirurgico è relativamente semplice e tecnicamente riproducibile rispetto ad altri metodi di inibizione della formazione dell'epidermide della ferita, ci sono diversi passaggi critici che possono influire sul successo dell'intervento chirurgico. In primo luogo, quando si tira il lembo intatto della pelle intera sui tessuti sottostanti esposti, è fondamentale che la pelle a tutto spessore non venga danneggiata in alcun modo. Il danno al lembo della pelle può ancora portare alla formazione di una piccola ferita epidermide, che può provocare una piccola escrescenza simile al blastema. In secondo luogo, assicurarsi che le suture non cadano durante le cure post-operatorie in quanto ciò può anche portare alla formazione di una piccola ferita epidermide. A questo punto, ridurre al minimo il potenziale contatto tra l'arto suturato e le eventuali superfici è importante, soprattutto durante la prima settimana post-operatoria. Diversi modi per prevenire questo comportano l'alloggiamento e l'anestesia dell'axolotl in un contenitore abbastanza grande in modo tale che l'axolotl abbia molto spazio per muoversi dopo l'intervento chirurgico.
Questo intervento chirurgico ha anche diverse limitazioni. Forse il più notevole è che il successo degli interventi chirurgici può essere valutato solo in due modi: utilizzando l'ambito di dissezione durante le prime due settimane di intervento chirurgico per cercare l'assenza di un'epidermide della ferita e / o controllando se si forma un blastema entro 3 settimane. Sebbene questi metodi siano efficaci, sono relativamente bassi. Lo sviluppo di futuri axolotl reporter transgenici per marcatori specifici dell'epidermide della ferita può aiutare in uno screening più rapido per interventi chirurgici di successo rispetto a quelli senza successo. Inoltre, questo intervento chirurgico è più difficile da eseguire su animali più giovani in quanto la pelle intatta è più fragile. Si raccomanda pertanto l'uso di axolotl sub-adulti o adulti.
Mentre questo intervento chirurgico è stato originariamente sviluppato in N. viridiscens19, è stato facilmente adattato per axolotls25,39 e può probabilmente essere applicato anche ad altre specie di salamandra. In sintesi, l'applicazione di questa tecnica a futuri studi rigenerativi sugli arti consentirà ai ricercatori di sviluppare più strumenti per affrontare la biologia dell'epidermide delle ferite e identificare i meccanismi sottostanti che guidano la sua funzione nell'avviare la formazione di blastema.

Da quando Lazzaro Spallanzani lo riportò nel 17681, la rigenerazione degli arti della salamandra è stato uno dei fenomeni rigenerativi naturali più studiati che ha innamorato i biologi per secoli. Il successo della rigenerazione degli arti dipende dalla formazione, dalla crescita e dal successivo pattern di una struttura cellulare indifferenziata nota come blastema. I ricercatori hanno fatto passi da gigante nella comprensione della composizione cellulare del blastema e di quali tessuti e tipi cellulari di supporto sono necessari per la sua formazione2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tuttavia, i meccanismi di segnalazione coordinati tra diversi tessuti e tipi di cellule che portano all'inizio della formazione di blastema rimangono poco compresi.
Un requisito chiave per il successo della formazione e della rigenerazione del blastema è l'epidermide della ferita, un epitelio transitorio e specializzato che copre il piano di amputazione entro 12 ore dopo l'amputazione10. Dopo l'amputazione, le cellule epiteliali dalla pelle intatta prossimale alla lesione migrano rapidamente sul piano di amputazione per formare un sottile epitelio della ferita14. Quando il blastema si forma nelle settimane successive, l'epidermide della ferita precoce si sviluppa in una struttura di segnalazione epiteliale più spessa chiamata cappuccio epiteliale apicale (AEC)15. Mentre la normale pelle a tutto spessore contiene sia uno strato epiteliale che uno strato dermico separati da una lamina basale, l'epidermide/AEC della ferita è costituita solo da uno strato epiteliale e manca di una lamina basale16,17. L'assenza della lamina basale e del derma consente il contatto diretto tra le cellule epiteliali della ferita e i tessuti sottostanti, il che facilita la segnalazione bidirezionale tra i due compartimenti che è fondamentale sia per la formazione che per il mantenimento del blastema17,18.
Studi sperimentali classici hanno ideato vari metodi chirurgici innovativi per sondare la funzione e la necessità dell'epidermide della ferita / AEC inibendo la sua formazione. Questi metodi includevano la sutura19 o l'innesto di pelle a tutto spessore20,21 sul piano di amputazione, la sutura immediata dell'arto amputato nella cavità corporea22 e la continua rimozione giornaliera o irradiazione dell'epidermide precoce della ferita e AEC23,24. Complessivamente, questi esperimenti non solo hanno stabilito l'importanza dell'epidermide della ferita / AEC, ma hanno anche ulteriormente determinato i suoi ruoli nell'istolisi tissutale precoce, oltre a mantenere la proliferazione delle cellule progenitrici e la crescita blastemica13 durante la rigenerazione.
Tuttavia, questi studi precedenti erano in gran parte limitati alla colorazione istologica e agli impulsi triziati di timidina per tracciare la proliferazione cellulare. In effetti, la rivisitazione di questi esperimenti classici con le moderne tecnologie di sequenziamento e tecniche funzionali nelle salamandre è stata fatta solo di recente e ha portato alla scoperta di ruoli aggiuntivi per l'epidermide della ferita nella modulazione dell'infiammazione e della degradazione / deposizione di ECM durante le prime fasi della rigenerazione25. Con il rilascio di varie sequenze del genoma e del trascrittoma della salamandra26,27,28,29,30,31,32,33,34, nonché il crescente numero di metodi funzionali disponibili nelle specie di salamandra11,35,36,37,38 , i ricercatori sono ora ben posizionati per iniziare a svelare i meccanismi molecolari che guidano la formazione, la funzione e lo sviluppo dell'AEC dell'epidermide della ferita.
Sfortunatamente, molti di questi metodi classici utilizzati per inibire la formazione dell'epidermide della ferita sono tecnicamente impegnativi, presentando difficoltà di riproducibilità tra le repliche biologiche nello stesso esperimento. Ad esempio, il mantenimento degli innesti cutanei può essere difficile in quanto gli innesti possono eventualmente cadere dall'arto ospite e la rimozione dell'epidermide della ferita / AEC ogni giorno è difficile senza danneggiare i tessuti sottostanti. Inoltre, la sutura dell'arto amputato nella cavità corporea è impegnativa e richiede anche ulteriori lesioni nel sito di inserimento. D'altra parte, la sutura della pelle a tutto spessore immediatamente sul piano di amputazione è relativamente semplice, tecnicamente riproducibile e introduce danni tissutali minimi. Questo metodo chirurgico a lembo di pelle piena (FSF) è stato precedentemente sviluppato da Anthony Mescher nel 1976 nei tritoni adulti (Notophthalmus viridiscens). Ha dimostrato che la chirurgia FSF ha inibito la formazione e la funzione dell'epidermide della ferita proibendo sia la migrazione delle cellule epiteliali sul piano di amputazione sia il contatto diretto tra le cellule epiteliali e i tessuti sottostanti.
Qui, questa procedura chirurgica viene mostrata passo dopo passo usando l'arto axolotl. Accoppiata con le moderne tecnologie molecolari e di sequenziamento, questa tecnica può rivelarsi molto utile per i ricercatori per approfondire la nostra comprensione della formazione e della funzione dell'epidermide della ferita / AEC durante la rigenerazione degli arti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Esperimenti classici di biologia rigenerativa della salamandra nel corso dell'ultimo secolo hanno da tempo stabilito che l'epidermide della ferita è una struttura di segnalazione cruciale che si forma rapidamente dopo l'amputazione ed è necessaria per la rigenerazione degli arti. Tuttavia, i metodi per studiare la sua precisa funzione a livello molecolare negli ultimi decenni sono stati limitati a causa della scarsità di tecniche funzionali precise e informazioni genomiche disponibili nei sistemi modello di salamandra. È eccitante, la recente pletora di tecnologie di sequenziamento accoppiata con il rilascio di vari genomi di salamandra e l'avvento di metodi di test genetici funzionali, tra cui CRISPR, consente di rivisitare questi esperimenti fondamentali a una risoluzione molecolare senza precedenti. Qui, descrivo come eseguire la chirurgia del lembo di pelle piena (FSF) sviluppata classicamente negli axolotl adulti al fine di inibire la formazione dell'epidermide della ferita immediatamente dopo l'amputazione. L'epidermide della ferita si forma normalmente attraverso la migrazione distale delle cellule epiteliali nella pelle prossimale al piano di amputazione per sigillare la ferita dall'ambiente esterno. L'intervento comporta la sutura immediata della pelle a tutto spessore (che comprende sia gli strati epidermico che dermica) sul piano di amputazione per ostacolare la migrazione delle cellule epiteliali e il contatto con i tessuti mesenchimali danneggiati sottostanti. Gli interventi chirurgici di successo provocano l'inibizione della formazione di blastema e la rigenerazione degli arti. Combinando questo metodo chirurgico con le analisi molecolari e funzionali a valle contemporanee, i ricercatori possono iniziare a scoprire le basi molecolari della funzione dell'epidermide della ferita e della biologia durante la rigenerazione degli arti.

Questo protocollo chirurgico consentirà la completa inibizione della formazione dell'epidermide della ferita (Figura 1) e, in definitiva, la rigenerazione degli arti. Un intervento chirurgico di successo non provoca la formazione di blastema in circa 2-3 settimane a seconda delle dimensioni dell'animale, mentre il controllo degli arti rigeneranti dovrebbe formare normalmente un blastema.
I ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato ad occhio nudo ogni 2-3 giorni per assicurarsi che le suture non siano spuntate e che non si stia formando un blastema. Se una o più delle suture spuntano fuori, può ancora formarsi un'epidermide della ferita con conseguente blastema piccolo o grande e un intervento chirurgico senza successo (Figura 2). Inoltre, i ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato almeno una volta alla settimana sotto uno stereomicroscopio per assicurarsi che un'epidermide sottile della ferita non sia evidente da nessuna parte sulla superficie di amputazione. Per confronto, i ricercatori dovrebbero anche esaminare l'arto rigenerante di controllo che dovrebbe avere un'epidermide avvolta sul piano di amputazione e formare un blastema per 2-3 settimane. L'epidermide della ferita apparirà sottile e chiara, mentre la pelle normale apparirà più opaca e rosa pallido (quasi bianca), giallo chiaro o verde scuro rispettivamente negli axolotl leucistici, albini o wildtype.
Se i ricercatori desiderano raccogliere il tessuto prima delle fasi di formazione del blastema a 2-3 settimane, dovrebbero ispezionare gli arti suturati prima della raccolta del campione per assicurarsi che le suture rimangano in posizione e che non si formi una piccola ferita epidermide. Inoltre, sezionare sagitalmente attraverso il tessuto dell'arto suturato ed eseguire analisi istologiche in qualsiasi momento può anche verificare la presenza del derma dal lembo di pelle intera che circonda l'intero piano di amputazione e l'assenza di un'epidermide della ferita (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figura 1: Schema delle fasi dell'intervento chirurgico del lembo di pelle completa. I passaggi del protocollo sono numerati e schematizzati qui. Le linee tratteggiate denotano i piani di amputazione ai passaggi 1 e 3 del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figura 2: Esempi di interventi chirurgici di lembo di pelle piena di successo e senza successo. Immagine rappresentativa in campo luminoso di un arto che ha subito un intervento chirurgico di successo (a sinistra), un intervento chirurgico senza successo (a destra) e un arto rigenerante di controllo (nessun intervento chirurgico) a 25 giorni dopo l'amputazione (dpa). L'intervento chirurgico di successo ha un piano di amputazione piatto in cui è stato suturato il lembo di pelle intera, mentre l'intervento chirurgico non riuscito ha un piccolo blastema in via di sviluppo. Le punte di freccia denotano il piano di amputazione e le linee tratteggiate bianche sono lì per aiutare la visualizzazione dell'assenza di un blastema nell'intervento chirurgico di successo e la presenza di blastemi nell'intervento chirurgico non riuscito e controllare gli arti rigeneranti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figura 3: Colorazione istologica degli arti normali rigeneranti e suturati FSF. (A-B») Immagini rappresentative in campo luminoso di sezioni colorate di picro-mallory da arti rigeneranti (A-A') e suturati axolotl (B-B') a 7 dpa. Gli inserti in A e B sono mostrati rispettivamente in A' e B'. Lo strato dermico pesante di collagene si allinea e copre l'intero piano di amputazione in arti suturati. Il piano di amputazione è indicato da punte di freccia in A-B. Le barre di scala rappresentano 500 μm. Questa cifra è stata adattata da Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

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Research

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Biology

3.0K Views.  Harvard University. Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Video: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Ricerca

Biologia

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...