Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

L'autore ringrazia Doug per il suo costante incoraggiamento e supporto incrollabile, così come i membri del laboratorio Melton per i loro utili feedback e commenti sul manoscritto. L'autore desidera anche ringraziare l'Harvard Office of Animal Resources (OAR) per la cura degli animali dedicata.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida IACUC (Protocollo #: 11-32) e AAALAC presso l'Università di Harvard.
1. Preparazione di soluzioni e configurazione per l'anestesia e il recupero
<ol><li>Preparare una soluzione fresca di tricaina allo 0,1% per l'anestesia e una soluzione di sale sodico allo 0,5% di sulfamerazina per il recupero. Rendere le soluzioni con acqua adatta per l'allevamento axolotl37 secondo i protocolli IACUC approvati presso l'istituto di ricerca competente (soluzione di Holtfreter modificata, ad esempio). Assicurarsi che le soluzioni siano ben miscelate e che sia preparato un volume sufficiente per immergere l'intero axolotl.<ol>
<li>Per preparare la soluzione di tricaina allo 0,1%, mescolare 1 g di tricaina e 1 g di bicarbonato di sodio con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta.</li>
		<li>Per preparare la soluzione di sale sodico di sulfamerazina allo 0,5%, mescolare 5 g di sale sodico di sulfamerazina con 1 L di acqua. La soluzione può essere scalata secondo questa ricetta. La soluzione di sulfamerazina è un antibiotico che previene l'infezione batterica durante il recupero chirurgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica spruzzandola con Clidox-S o etanolo al 70%. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (pinze, forbici per sezionare, forbici a molla) mediante autoclave. Se si eseguono più interventi chirurgici, assicurarsi di sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a perline calde tra gli animali.</li>
	<li>Per impostare l'area di recupero, posizionare una capsula di Petri da 15 cm o qualsiasi contenitore che si adatti all'axolotl sopra un secchio pieno di ghiaccio bagnato. Riempire la capsula di Petri con un basso livello di soluzione di sale sodico allo 0,5%, abbastanza tale che l'axolotl non sarebbe completamente sommerso. Il recupero sul ghiaccio post-operatorio rallenterà il movimento dell'animale mentre si risveglia dall'anestesia, consentendo all'area suturata di guarire relativamente indisturbata. NOTA: questa configurazione può essere personalizzata dai ricercatori a seconda dei materiali che hanno a disposizione.</li>
</ol>2. Esecuzione della procedura chirurgica del lembo della pelle completa
<ol><li>Anestetizzare l'axolotl immergendolo in un contenitore di soluzione di tricaina allo 0,1%. Questo richiederà circa 15-20 minuti. Assicurarsi che l'axolotl sia effettivamente completamente anestetizzato eseguendo un pizzico di coda. Se non c'è risposta dall'axolotl, procedere con l'intervento chirurgico. NOTA: Utilizzare axolotl più vecchi e più grandi per questo intervento chirurgico (almeno 15 cm di dimensione). Assicurarsi che l'axolotl rimanga ben idratato durante l'intervento chirurgico bagnando periodicamente la pelle con acqua del sistema axolotl usando una pipetta di plastica. Assicurarsi di preparare asetticamente il sito chirurgico irrigando l'area con PBS sterile prima dell'intervento chirurgico. L'animale deve anche essere posto su un drappo chirurgico sterile per la procedura.</li>
	<li>Eseguire un'amputazione dell'arto all'estremità distale degli elementi scheletrici zeugopodiali utilizzando le forbici di dissezione (Figura 1.1).</li>
	<li>Usando le forbici a molla, fare una piccola incisione (circa 2 mm) sulla porzione ventrale della pelle (Figura 1.2).</li>
	<li>Usando la pinza, staccare con cura la pelle approssimativamente sulla linea mediana degli elementi scheletrici zeugopodiali, esponendo i tessuti degli arti sottostanti (muscoli, ossa, ecc.) (Figura 1.3). Assicurati di non danneggiare la pelle. Vedere la nota dopo il passaggio 2.8.</li>
	<li>Amputare i tessuti degli arti sottostanti esposti sulla linea mediana dello zeugopode usando forbici chirurgiche (Figura 1.4).</li>
	<li>Spingere indietro il tessuto muscolare con le forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto. NOTA: Questo è necessario per garantire una migliore guarigione e anche per aumentare il successo dell'intervento chirurgico in quanto l'osso sporgente può essere frastagliato contro il lembo suturato e interrompere l'integrità di un lembo di pelle intatto in seguito.</li>
	<li>Utilizzando la pinza, tirare con attenzione la pelle extra a tutto spessore sul piano di amputazione per coprire i tessuti sottostanti esposti e suturare in posizione collegandosi con la pelle ventrale a tutto spessore (Figura 1.5).</li>
	<li>Suturare i restanti lati destro e sinistro del lembo della pelle nelle porzioni ventrali sottostanti della pelle intatta. Questo può essere fatto suturando i lati del lembo in modo "incrociato" (consigliato) (Figura 1.6-1.9), o semplicemente suturando direttamente nella pelle ventrale. Utilizzare la pinza e le forbici a molla curve per la sutura. Assicurarsi che non si vedano tessuti sottostanti esposti e che le suture siano legate strettamente (annodate almeno tre volte). NOTA: è fondamentale che la pelle intatta non sia danneggiata nei passaggi 2.4, 2.7-2.8. Abbiamo scoperto che il danno alla pelle a tutto spessore è stato correlato con interventi chirurgici non riusciti, poiché le aree di danno possono ancora formare una piccola ferita epidermide. Se possibile, prova a utilizzare un paio di pinze più opache quando consegni il lembo della pelle a tutto spessore.</li>
	<li>Eseguire un'amputazione sull'arto controlaterale (controllo animale interno opzionale) amputandolo a livello medio zeugopode con forbici chirurgiche. Spingere indietro il tessuto muscolare con forbici chirurgiche e tagliare l'osso esposto. NOTA: Un controllo interno dell'arto controlaterale può essere fatto per valutare meglio il successo dell'intervento chirurgico durante la fase 4 nello stesso animale. Tuttavia, l'amputazione dello stesso arto in un animale separato può anche essere utilizzata per fungere da controllo.</li>
</ol>3. Recupero e cura post-operatoria
<ol><li>Una volta completato l'intervento chirurgico, posizionare un Kimwipe o un tovagliolo di carta sterile sul fondo del contenitore o della capsula di Petri per bagnarlo. Metti l'animale nel contenitore su ghiaccio bagnato e avvolgi delicatamente le estremità esposte del Kimwipe o del tovagliolo di carta intorno alla parte superiore dell'animale per mantenerlo ben idratato con la soluzione di sulfamerazina. Lasciare sul ghiaccio bagnato per 30 minuti a 1 ora per garantire un movimento minimo durante il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Posizionare l'animale in un contenitore statico con soluzione di sulfamerazina allo 0,5%. Gli axolotl devono rimanere in questa soluzione per le prime 24 ore al fine di prevenire l'infezione.</li>
	<li>Posizionare l'axolotl nell'acqua normale del sistema e monitorare quotidianamente la salute. Assicurarsi che nessuna sutura cada ogni giorno in quanto ciò può causare la formazione di una piccola ferita epidermide che confonderà i risultati. NOTA: Assicurarsi che il contenitore dell'alloggiamento disponga di ampio spazio per il movimento dell'axolotl e ridurre al minimo le possibilità che l'arto suturato sull'axolotl possa entrare in contatto con i lati del contenitore. Ciò contribuirà a garantire che le suture rimangano in posizione, specialmente durante la prima settimana dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>4. Valutare il successo dell'intervento chirurgico al microscopio stereoscopico
NOTA: Si consiglia di controllare gli animali al microscopio stereo almeno una volta alla settimana per valutare l'integrità del lembo di pelle completa e il successo dell'intervento chirurgico.
<ol><li>Anestetizzare l'axolotl in 0,1% di tricaina come nel passaggio 2.1. Assicurati che ci sia ampio spazio nel contenitore per far muovere l'axolotl.</li>
	<li>Se si ispeziona durante le prime due settimane dopo l'intervento chirurgico, ispezionare l'arto suturato utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che non siano spuntate suture e che un'epidermide della ferita sottile chiara non sia visibile da nessuna parte. Se si ispeziona la terza settimana dopo l'intervento chirurgico o più tardi, assicurarsi che non si sia formato un blastema e confrontare con il modo in cui il normale arto amputato di controllo (dallo stesso animale o da un animale diverso) è progredito durante la rigenerazione (cioè, se si è formato un blastema).</li>
	<li>Al termine, riportare l'axolotl alle normali condizioni di acqua e allevamento del sistema.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. 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Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici di lembo di pelle intera negli arti axolotl per inibire la formazione dell'epidermide della ferita. Mentre questo intervento chirurgico è relativamente semplice e tecnicamente riproducibile rispetto ad altri metodi di inibizione della formazione dell'epidermide della ferita, ci sono diversi passaggi critici che possono influire sul successo dell'intervento chirurgico. In primo luogo, quando si tira il lembo intatto della pelle intera sui tessuti sottostanti esposti, è fondamentale che la pelle a tutto spessore non venga danneggiata in alcun modo. Il danno al lembo della pelle può ancora portare alla formazione di una piccola ferita epidermide, che può provocare una piccola escrescenza simile al blastema. In secondo luogo, assicurarsi che le suture non cadano durante le cure post-operatorie in quanto ciò può anche portare alla formazione di una piccola ferita epidermide. A questo punto, ridurre al minimo il potenziale contatto tra l'arto suturato e le eventuali superfici è importante, soprattutto durante la prima settimana post-operatoria. Diversi modi per prevenire questo comportano l'alloggiamento e l'anestesia dell'axolotl in un contenitore abbastanza grande in modo tale che l'axolotl abbia molto spazio per muoversi dopo l'intervento chirurgico.
Questo intervento chirurgico ha anche diverse limitazioni. Forse il più notevole è che il successo degli interventi chirurgici può essere valutato solo in due modi: utilizzando l'ambito di dissezione durante le prime due settimane di intervento chirurgico per cercare l'assenza di un'epidermide della ferita e / o controllando se si forma un blastema entro 3 settimane. Sebbene questi metodi siano efficaci, sono relativamente bassi. Lo sviluppo di futuri axolotl reporter transgenici per marcatori specifici dell'epidermide della ferita può aiutare in uno screening più rapido per interventi chirurgici di successo rispetto a quelli senza successo. Inoltre, questo intervento chirurgico è più difficile da eseguire su animali più giovani in quanto la pelle intatta è più fragile. Si raccomanda pertanto l'uso di axolotl sub-adulti o adulti.
Mentre questo intervento chirurgico è stato originariamente sviluppato in N. viridiscens19, è stato facilmente adattato per axolotls25,39 e può probabilmente essere applicato anche ad altre specie di salamandra. In sintesi, l'applicazione di questa tecnica a futuri studi rigenerativi sugli arti consentirà ai ricercatori di sviluppare più strumenti per affrontare la biologia dell'epidermide delle ferite e identificare i meccanismi sottostanti che guidano la sua funzione nell'avviare la formazione di blastema.

Da quando Lazzaro Spallanzani lo riportò nel 17681, la rigenerazione degli arti della salamandra è stato uno dei fenomeni rigenerativi naturali più studiati che ha innamorato i biologi per secoli. Il successo della rigenerazione degli arti dipende dalla formazione, dalla crescita e dal successivo pattern di una struttura cellulare indifferenziata nota come blastema. I ricercatori hanno fatto passi da gigante nella comprensione della composizione cellulare del blastema e di quali tessuti e tipi cellulari di supporto sono necessari per la sua formazione2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tuttavia, i meccanismi di segnalazione coordinati tra diversi tessuti e tipi di cellule che portano all'inizio della formazione di blastema rimangono poco compresi.
Un requisito chiave per il successo della formazione e della rigenerazione del blastema è l'epidermide della ferita, un epitelio transitorio e specializzato che copre il piano di amputazione entro 12 ore dopo l'amputazione10. Dopo l'amputazione, le cellule epiteliali dalla pelle intatta prossimale alla lesione migrano rapidamente sul piano di amputazione per formare un sottile epitelio della ferita14. Quando il blastema si forma nelle settimane successive, l'epidermide della ferita precoce si sviluppa in una struttura di segnalazione epiteliale più spessa chiamata cappuccio epiteliale apicale (AEC)15. Mentre la normale pelle a tutto spessore contiene sia uno strato epiteliale che uno strato dermico separati da una lamina basale, l'epidermide/AEC della ferita è costituita solo da uno strato epiteliale e manca di una lamina basale16,17. L'assenza della lamina basale e del derma consente il contatto diretto tra le cellule epiteliali della ferita e i tessuti sottostanti, il che facilita la segnalazione bidirezionale tra i due compartimenti che è fondamentale sia per la formazione che per il mantenimento del blastema17,18.
Studi sperimentali classici hanno ideato vari metodi chirurgici innovativi per sondare la funzione e la necessità dell'epidermide della ferita / AEC inibendo la sua formazione. Questi metodi includevano la sutura19 o l'innesto di pelle a tutto spessore20,21 sul piano di amputazione, la sutura immediata dell'arto amputato nella cavità corporea22 e la continua rimozione giornaliera o irradiazione dell'epidermide precoce della ferita e AEC23,24. Complessivamente, questi esperimenti non solo hanno stabilito l'importanza dell'epidermide della ferita / AEC, ma hanno anche ulteriormente determinato i suoi ruoli nell'istolisi tissutale precoce, oltre a mantenere la proliferazione delle cellule progenitrici e la crescita blastemica13 durante la rigenerazione.
Tuttavia, questi studi precedenti erano in gran parte limitati alla colorazione istologica e agli impulsi triziati di timidina per tracciare la proliferazione cellulare. In effetti, la rivisitazione di questi esperimenti classici con le moderne tecnologie di sequenziamento e tecniche funzionali nelle salamandre è stata fatta solo di recente e ha portato alla scoperta di ruoli aggiuntivi per l'epidermide della ferita nella modulazione dell'infiammazione e della degradazione / deposizione di ECM durante le prime fasi della rigenerazione25. Con il rilascio di varie sequenze del genoma e del trascrittoma della salamandra26,27,28,29,30,31,32,33,34, nonché il crescente numero di metodi funzionali disponibili nelle specie di salamandra11,35,36,37,38 , i ricercatori sono ora ben posizionati per iniziare a svelare i meccanismi molecolari che guidano la formazione, la funzione e lo sviluppo dell'AEC dell'epidermide della ferita.
Sfortunatamente, molti di questi metodi classici utilizzati per inibire la formazione dell'epidermide della ferita sono tecnicamente impegnativi, presentando difficoltà di riproducibilità tra le repliche biologiche nello stesso esperimento. Ad esempio, il mantenimento degli innesti cutanei può essere difficile in quanto gli innesti possono eventualmente cadere dall'arto ospite e la rimozione dell'epidermide della ferita / AEC ogni giorno è difficile senza danneggiare i tessuti sottostanti. Inoltre, la sutura dell'arto amputato nella cavità corporea è impegnativa e richiede anche ulteriori lesioni nel sito di inserimento. D'altra parte, la sutura della pelle a tutto spessore immediatamente sul piano di amputazione è relativamente semplice, tecnicamente riproducibile e introduce danni tissutali minimi. Questo metodo chirurgico a lembo di pelle piena (FSF) è stato precedentemente sviluppato da Anthony Mescher nel 1976 nei tritoni adulti (Notophthalmus viridiscens). Ha dimostrato che la chirurgia FSF ha inibito la formazione e la funzione dell'epidermide della ferita proibendo sia la migrazione delle cellule epiteliali sul piano di amputazione sia il contatto diretto tra le cellule epiteliali e i tessuti sottostanti.
Qui, questa procedura chirurgica viene mostrata passo dopo passo usando l'arto axolotl. Accoppiata con le moderne tecnologie molecolari e di sequenziamento, questa tecnica può rivelarsi molto utile per i ricercatori per approfondire la nostra comprensione della formazione e della funzione dell'epidermide della ferita / AEC durante la rigenerazione degli arti.

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Esperimenti classici di biologia rigenerativa della salamandra nel corso dell'ultimo secolo hanno da tempo stabilito che l'epidermide della ferita è una struttura di segnalazione cruciale che si forma rapidamente dopo l'amputazione ed è necessaria per la rigenerazione degli arti. Tuttavia, i metodi per studiare la sua precisa funzione a livello molecolare negli ultimi decenni sono stati limitati a causa della scarsità di tecniche funzionali precise e informazioni genomiche disponibili nei sistemi modello di salamandra. È eccitante, la recente pletora di tecnologie di sequenziamento accoppiata con il rilascio di vari genomi di salamandra e l'avvento di metodi di test genetici funzionali, tra cui CRISPR, consente di rivisitare questi esperimenti fondamentali a una risoluzione molecolare senza precedenti. Qui, descrivo come eseguire la chirurgia del lembo di pelle piena (FSF) sviluppata classicamente negli axolotl adulti al fine di inibire la formazione dell'epidermide della ferita immediatamente dopo l'amputazione. L'epidermide della ferita si forma normalmente attraverso la migrazione distale delle cellule epiteliali nella pelle prossimale al piano di amputazione per sigillare la ferita dall'ambiente esterno. L'intervento comporta la sutura immediata della pelle a tutto spessore (che comprende sia gli strati epidermico che dermica) sul piano di amputazione per ostacolare la migrazione delle cellule epiteliali e il contatto con i tessuti mesenchimali danneggiati sottostanti. Gli interventi chirurgici di successo provocano l'inibizione della formazione di blastema e la rigenerazione degli arti. Combinando questo metodo chirurgico con le analisi molecolari e funzionali a valle contemporanee, i ricercatori possono iniziare a scoprire le basi molecolari della funzione dell'epidermide della ferita e della biologia durante la rigenerazione degli arti.

Questo protocollo chirurgico consentirà la completa inibizione della formazione dell'epidermide della ferita (Figura 1) e, in definitiva, la rigenerazione degli arti. Un intervento chirurgico di successo non provoca la formazione di blastema in circa 2-3 settimane a seconda delle dimensioni dell'animale, mentre il controllo degli arti rigeneranti dovrebbe formare normalmente un blastema.
I ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato ad occhio nudo ogni 2-3 giorni per assicurarsi che le suture non siano spuntate e che non si stia formando un blastema. Se una o più delle suture spuntano fuori, può ancora formarsi un'epidermide della ferita con conseguente blastema piccolo o grande e un intervento chirurgico senza successo (Figura 2). Inoltre, i ricercatori dovrebbero ispezionare l'arto suturato almeno una volta alla settimana sotto uno stereomicroscopio per assicurarsi che un'epidermide sottile della ferita non sia evidente da nessuna parte sulla superficie di amputazione. Per confronto, i ricercatori dovrebbero anche esaminare l'arto rigenerante di controllo che dovrebbe avere un'epidermide avvolta sul piano di amputazione e formare un blastema per 2-3 settimane. L'epidermide della ferita apparirà sottile e chiara, mentre la pelle normale apparirà più opaca e rosa pallido (quasi bianca), giallo chiaro o verde scuro rispettivamente negli axolotl leucistici, albini o wildtype.
Se i ricercatori desiderano raccogliere il tessuto prima delle fasi di formazione del blastema a 2-3 settimane, dovrebbero ispezionare gli arti suturati prima della raccolta del campione per assicurarsi che le suture rimangano in posizione e che non si formi una piccola ferita epidermide. Inoltre, sezionare sagitalmente attraverso il tessuto dell'arto suturato ed eseguire analisi istologiche in qualsiasi momento può anche verificare la presenza del derma dal lembo di pelle intera che circonda l'intero piano di amputazione e l'assenza di un'epidermide della ferita (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figura 1: Schema delle fasi dell'intervento chirurgico del lembo di pelle completa. I passaggi del protocollo sono numerati e schematizzati qui. Le linee tratteggiate denotano i piani di amputazione ai passaggi 1 e 3 del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figura 2: Esempi di interventi chirurgici di lembo di pelle piena di successo e senza successo. Immagine rappresentativa in campo luminoso di un arto che ha subito un intervento chirurgico di successo (a sinistra), un intervento chirurgico senza successo (a destra) e un arto rigenerante di controllo (nessun intervento chirurgico) a 25 giorni dopo l'amputazione (dpa). L'intervento chirurgico di successo ha un piano di amputazione piatto in cui è stato suturato il lembo di pelle intera, mentre l'intervento chirurgico non riuscito ha un piccolo blastema in via di sviluppo. Le punte di freccia denotano il piano di amputazione e le linee tratteggiate bianche sono lì per aiutare la visualizzazione dell'assenza di un blastema nell'intervento chirurgico di successo e la presenza di blastemi nell'intervento chirurgico non riuscito e controllare gli arti rigeneranti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figura 3: Colorazione istologica degli arti normali rigeneranti e suturati FSF. (A-B») Immagini rappresentative in campo luminoso di sezioni colorate di picro-mallory da arti rigeneranti (A-A') e suturati axolotl (B-B') a 7 dpa. Gli inserti in A e B sono mostrati rispettivamente in A' e B'. Lo strato dermico pesante di collagene si allinea e copre l'intero piano di amputazione in arti suturati. Il piano di amputazione è indicato da punte di freccia in A-B. Le barre di scala rappresentano 500 μm. Questa cifra è stata adattata da Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

Inibizione della formazione dell'epidermide della ferita tramite chirurgia del lembo della pelle completa durante la rigenerazione degli arti Axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Views.  Harvard University. Questo articolo descrive come eseguire un metodo chirurgico per inibire la formazione dell'epidermide della ferita durante la rigenerazione dell'arto axolotl suturando immediatamente la pelle a tutto spessore sul piano di amputazione. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i ruoli funzionali dell'epidermide della ferita durante le prime fasi della rigenerazione degli arti.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Genetica

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Modello apicale resezione mouse per primo studio Mammalian rigenerazione cardiaca

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Medicina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Biologia

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

Contusione Mitraglio Cavolo spinale con una MicrochirurgicA laminectomia nell'Axolotl Rigenerativo

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Un modello di resezione apicale nel cuore adulto di Xenopus tropicalis

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Utilizzo della fissazione della placca per studiare la guarigione ossea e la rigenerazione degli arti negli axolotl

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorare la rigenerazione negli axolotl attraverso approfondimenti sui meccanismi cellulari e molecolari, sulla guarigione ossea e sulle im

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

Stabilizzazione di un'osteotomia del femore con una fissazione della placca nell'Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...